PTEN对耐顺铂的食管癌细胞的增殖及P-糖蛋白表达的影响

目的探讨PTEN对耐顺铂食管癌Ec9706/c DDP细胞增殖及P-gp表达的影响.方法采用顺铂浓度梯度增加的方法筛选食管癌耐药细胞株Ec9706/c DDP,采用流式细胞术检测PTEN转染后对Ec9706/c DDP细胞周期和凋亡的影响,采用Western blot检测PTEN转染后Ec9706/c DDP细胞P-gp表达改变。结果通过顺铂浓度梯度增加的方法成功诱导食管癌耐顺铂细胞株Ec9706/c DDP,与Ec9706/c DDP和Ec9706/c DDP+空载相比,转染野生型PTEN的Ec9706/c DDP细胞G1期细胞比例增加,S期细胞明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。Ec9706/c DDP细胞株在野生型PTEN转染48 h后细胞凋亡率显著高于转染无活性G129E和C124S组,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示:转染野生型PTEN的Ec9706/c DDP细胞P-gp蛋白的表达显著下调,而转染2种突变型的PTEN组没有明显改变。结论 PTEN在食管癌耐顺铂细胞株Ec9706/c DDP过表达能够显著抑制肿瘤细胞增殖,促进其凋亡,降低肿瘤耐药关键蛋白P-gp表达,从而逆转食管癌细胞的多药耐药。     

人白介素21基因联合γ射线照射对食管癌ECl09细胞厨期的影响

目的研究含有IL-21基因的重组腺病毒表达载体（Ad-IL-21）联合γ射线照射对食管癌细胞ECl09生长的抑制作用,为肿瘤的基因-放射治疗提供实验依据。方法将Ad-IL-21于体外转染食管癌细胞株ECl09,用M1Tr比色法和流式细胞术观察基因联合照射后ECl09细胞的生长曲线和细胞周期的变化。结果Ad-IL-2l基因组、单纯照射组和Ad-IL-2l基因联合照射组ECl09细胞生长均明显受到抑制,与Ad-lacZ组和空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。其中联合照射组ECl09细胞生长最为缓慢,与Ad-IL-2l基因组和单纯照射组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。Ad-IL-21基因组、单纯照射组和联合治疗组大量的ECl09细胞停留在G1期,而G2期和s期细胞明显减少,联合治疗组细胞停留在G1期最多。结论腺病毒介导的白介素21基因转移能显著抑制食管癌ECl09细胞的生长,使细胞产生G1期阻滞,与放射治疗联合应用具有相加和协同效应。     

p27kip1基因转移抑制大鼠胶质瘤生长的实验研究

[目的]探讨重组腺病毒介导的人突变型p27kip1基因（Ad-p27kip1）表达对大鼠神经胶质瘤移植瘤生长的抑制作用。[方法]建立大鼠胶质瘤移植瘤模型,随机分成3组：Ad-p27组、Ad-LacZ组、PBS组。Ad-p27组给予腺病毒介导的人p27 kip1基因（Ad-p27kip1）瘤内注射,另2组分别给予Ad-LacZ和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测P27和CyclinD1的表达;原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡情况。[结果]给予Ad-p27kip1基因治疗的实验组大鼠肿瘤生长受到明显抑制;在颅内肿瘤模型组给予Ad-p27治疗的大鼠生存时间明显延长;免疫荧光染色显示移植瘤P27表达明显增强,CyclinD1的表达受到抑制。Ad-p27组细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和PBS组。[结论]腺病毒介导的人p27基因（Ad-p27kip1）对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制是增强p27表达、抑制CyclinD1的表达、诱导胶质瘤细胞凋亡。     

腺病毒介导野生型p53基因转染对人胃癌细胞系的作用

目的　观察野生型p5 3基因 (wtp5 3 )对体外培养人胃癌细胞系生长的抑制作用 ,探讨野生型p5 3基因在胃癌基因治疗中的重要意义。方法　以携带有野生型p5 3基因的复制缺陷型腺病毒 (pAd -p5 3 )为载体 ,转染有p5 3基因突变的人胃癌细胞系BGC -790 1。应用生化染色 ,检测外源基因的转染效率 ;应用免疫组化、原位杂交等方法检测外源基因的表达效果 ;应用细胞计数、MTT法检测pAd -p5 3转染对胃癌细胞生长的抑制效果 ;应用流式细胞仪检测细胞周期。结果　当腺病毒在 10 0MOI以上效靶比转染人胃癌细胞系时 ,转染效率达 10 0 %。转染 3d以后 ,胃癌细胞中突变性p5 3蛋白表达开始减少 ,野生型p5 3mRNA的表达开始增多 ,BGC -790 1细胞生长受到明显抑制 ,流式细胞仪检测显示G0 /G1期细胞数增加 (未转染组 5 6 47% ,转染pAd -p5 3组 79 40 % ,P<0 0 5 ) ,S期细胞数减少 (未转染组 3 0 80 % ,转染pAd -p5 3组 13 81% ,P <0 0 1)。结论　腺病毒介导的野生型p5 3基因体外转染人胃癌细胞 ,可有效抑制胃癌细胞的生长 ,可能成为胃癌基因治疗的手段之一。     

LincRNA-p21抑制食管癌细胞增殖的机制

[目的]探讨基因间的长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA,LincRNA)-p21抑制食管癌细胞增殖的调控及机制。[方法]应用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)技术,检测LincRNA-p21在2株食管癌细胞(EC109和EC9706)与1株永生化食管上皮细胞(Het-1A)以及64例食管癌组织与癌旁组织中的表达情况。携带LincRNA-p21基因全长的慢病毒成功转染食管癌EC109后,通过流式细胞术检测食管癌细胞EC109的周期分布,Ed U染色法分析EC109的增殖情况。同时,采用RT-qPCR和Western blot技术分别检测LincRNA-p21下游基因p21的mRNA水平和蛋白表达水平,以及cyclin D蛋白水平。[结果]EC109和EC9706中LincRNA-p21水平分别为Het-1A的18%和32%(P0.05);p21的mRNA水平分别为Het-1A的42%和48%。以EC109为靶细胞进行慢病毒转染后,LincRNA-p21相对表达量增加约14 860倍(P0.05),p21的mRNA上调约1.83倍(P0.05)。细胞周期分布结果显示,LincRNA-p21转染组其G1期细胞增加,S期和G2期细胞减少(P0.05),增殖指数(40.4%)低于阴性对照(48.2%)(P0.05)。Ed U增殖分析结果显示上调LincRNA-p21后,细胞增值率明显降低。Western blot结果显示过表达LincRNA-p21下调cyclin D蛋白水平。     

腺病毒介导的人突变p27基因转染对人大肠癌细胞系的作用

目的　用人重组p2 7mt腺病毒感染大肠癌细胞株SW 480 ,研究p2 7mt对大肠癌细胞的抑制作用。方法　用重组腺病毒Ad -p2 7mt转染SW 480后 ,用Westernblot检测目的基因的表达 ;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析 ,绘制生长曲线观察对细胞的生长抑制作用。结果　Ad -p2 7mt转染SW 480后 ,通过Westernblot分析发现p2 7在细胞中出现了高表达 ;PI染色流式细胞仪检测 ,77 9%的细胞阻滞于G0 /G1 期 ,而Ad -LacZ组及空白对照组分别为 2 5 5 7%和 2 5 2 9%(P <0 0 0 1) ;由生长曲线可以看出Ad -p2 7mt于 2 4h内对细胞就有明显的抑制作用 ( P<0 0 5 ) ,且持续时间长。结论　重组腺病毒能够有效转染p2 7mt基因进入SW480细胞内并获得了高表达 ;p2 7mt对细胞周期有明显的阻滞作用且对细胞的生长有明显的抑制作用。突变p2 7是一种细胞周期高效阻滞因子和高效生长抑制因子 ,为p2 7基因治疗大肠癌开辟了一条新途径     

Caspase-6诱导肾癌细胞株GRC-1细胞凋亡的研究

目的　探讨 Caspase- 6在肾癌细胞株 GRC- 1中的表达及其对肾癌细胞的凋亡诱导作用。方法　应用 RT- PCR方法检测了肾癌细胞株 GRC- 1中 Caspase- 6基因的表达水平 ;以腺病毒 adv5作载体 ,构建了含 Caspase- 6基因的转基因载体 ,用脂质体包裹法转染 GRC- 1细胞株 ,用 RT-PCR方法检测转染后 GRC- 1细胞中 Caspase- 6基因的表达。 MTT法检测转染 Caspase- 6对GRC- 1细胞株生长的影响。结果　肾癌细胞株 GRC- 1中未检出 Caspase- 6表达。 RT- PCR法证实转染 Caspase- 6后 GRC- 1中 Caspase- 6表达明显 ,MTT检测显示对 GRC- 1细胞的生长有抑制作用 ,通过形态学观察及 DNA电泳证实这种作用主要是通过促进细胞凋亡而实现的。结论　 Cas-pase- 6对肾癌细胞的生长有抑制作用 ,并可诱导肾癌细胞凋亡。     

腺病毒介导PTEN基因抑制肝癌体外生长和侵袭力的研究

目的探讨腺病毒介导PTEN基因对肝癌细胞株H22体外生长和侵袭力的影响。方法以Ad-PTEN、Ad-PTEN^G-129R质粒及空载质粒分别转染体外培养肝癌细胞株H22，并以来转染组为对照，用RT-PCR检测目的基因，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞活力，通过Boyden小室法检测肝癌细胞株H22体外侵袭力的变化。结果RT-PCR显示Ad-PTEN-H22组、Ad-PTEN^G-129R-H22组的H22细胞相应基因mRNA表达呈阳性条带，表明有PTEN和PTEN^G-129R的表达；在细胞活力检测上，Ad-PTEN-H22组550nm波长光吸收值为0.5627±0.0633，表明该组活细胞数明显低于其他各组（P〈0．05）；Ad-PTEN-H22组的侵袭细胞数为（15.64±3．27）％，低于其他组（P〈0.05）。结论重组腺病毒载体介导的PTEN基因转染可抑制肝癌细胞株H22体外生长并且其体外侵袭力受到明显抑制。     

Caspase—6诱导肾癌细胞株GRC—1细胞凋亡的研究

目的 探讨Caspase-6在肾癌细胞株GRC－1中的表达及其对肾癌细胞的凋亡诱导作用。方法 应用RT－PCR方法检测了肾癌细胞株GRC－1中Caspase-6基因的表达水平；以腺病毒adv5作载体，构建了含Caspase-6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染GRC－1细胞株，用RT－PCR方法检测转染后GRC－1细胞中Caspase-6基因的表达。MTT法检测转染Caspase-6对GRC－1细胞株生长的影响。结果 肾癌细胞株GRC－1中未检出Caspase-6表达。RT－PCR法证实转染Caspase-6后GRC－1中Caspase-6表达明显，MTT检测显示对GRC－1细胞的生长有抑制作用，通过形态学观察及DNA电泳证实这种作用主要是通过促进细胞凋亡而实现的。结论 Caspase-6对肾癌细胞的生长有抑制作用，并可诱导肾癌细胞凋亡。     

人IL-21基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的 研究含有IL-21基因的重组腺病毒表达载体(Ad-IL-21)抑制人卵巢癌细胞生长的作用。方法 Ad-IL-21重组体于体外转染卵巢癌细胞株ES-2,用MTT比色法和流式细胞术观察ES-2细胞的生长曲线和细胞周期的变化。结果 Ad-IL-21组ES-2细胞的生长比空白对照组和对照腺病毒组慢,在转染后第3天开始生长明显缓慢(P<0.05),转染后第5天Ad-IL-21组的细胞生长基本稳定在一定水平(P<0.05)。Ad-IL-21转染后ES-2细胞停留在G₁期细胞增加,而G₂期和S期细胞减少。结论 腺病毒介导的外源性IL-21基因可有效转染人卵巢癌细胞,并对其生长有抑制作用。     

重组腺病毒介导人野生型p53基因转染神经母细胞瘤细胞系的实验研究

目的 观察人野生型p53基因(wt-p53)转染对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.结果 以携带绿色荧光蛋白的腺病毒质粒(Ad-GFP)转染SH-SY5Y细胞,通过流式细胞仪(FCM)判断转染效率.确定合适的感染倍数(MOI).分别以空病毒质粒(Ad)及携带wt-p53的腺病毒质粒(Ad-p53)转染SH-SY5Y细胞,即对照组和p53组;并以未转染的肿瘤细胞为空白对照(空白组).采用Western blot免疫印迹法检测p53蛋白的表达.观察转染前后细胞生长情况,绘制生长曲线,通过FCM分析细胞周期分布及细胞凋亡情况.结果 检测结果 表明腺病毒对SH-SY5Y细胞有较高的转染率,100MOI为合适的转染倍数.Ad-p53转染SH-SY5Y细胞后,wt-p53基因得到了高效表达.与空白组和对照组相比,p53组细胞生长曲线上升减缓,生长速度减慢,细胞凋亡增加,G1期细胞比例增加(P<0.01).结论 wt-p53基因转染可以有效抑制SH-SY5Y细胞的生长,这为p53基因修饰的肿瘤疫苗用于神经母细胞瘤的临床治疗提供了体外实验依据.     

人IL-21基因联合γ射线照射对子宫颈癌Hela细胞生长的影响

目的 研究含人IL-21基因的重组腺病毒(Ad-IL-21)联合γ射线照射对子宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用。方法 重组腺病毒Ad-IL-21于体外转染子宫颈癌Hela细胞,转染后6 h进行6Gy ¹³⁷Cs γ射线照射,用MTT方法和流式细胞仪测定Hela细胞的生长曲线、抑制率及细胞周期。结果 Ad-IL-21基因组、照射组和基因联合照射组对Hela细胞生长均具有抑制作用,联合照射组的抑制效应最强(44%),明显高于Ad-IL-21组和照射组。联合照射组Hela细胞出现明显的G1期阻滞,G1期细胞所占比例最高,达到88.9%,S期细胞最少(1%)。结论 IL-21基因联合γ射线照射对子宫颈癌的抑瘤作用具有协同效应,有效地抑制肿瘤细胞的生长。     

杏多糖与阿魏菇醇提物对食管癌细胞凋亡及其调控影响的体外实验研究

目的观察杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞Eca9706的凋亡作用及其作用机制。方法采用体外细胞培养,以免疫细胞化学和分子生物学技术观察10^-1g/ml杏多糖与阿魏蘑菇醇提物对食管癌细胞细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响。结果免疫细胞化学结果显示,食管癌细胞经两种受试物处理24h后,Bax的表达较处理前有所增加;Bcl-2表达未见下降,反而有增高的趋势。经HE染色,在光学显微镜下可见,经10^-1g/ml的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物干预后的食管癌细胞出现了凋亡细胞的形态学特征;TUNEL测试结果显示食管癌细胞核的DNA断裂片段较处理前增多;琼脂凝胶电泳显示一片模糊的弥散带。结论10^-1g/ml的杏多糖与阿魏蘑菇醇提物可促进食管癌细胞抑癌基因Bax的表达,并促进细胞的凋亡。     

Retinoblastoma 94 enhances radiation treatment of esophageal squamous cell carcinoma in vitro and in vivo

We performed the study to investigate whether adenovirus-mediated retinoblastoma 94 (RB94) gene transfer could enhance radiation treatment of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) in vitro and in vivo. ESCC cells (Kyse150 cell line) were cultivated in vitro and tumors originated from the cell line were propagated as xenografts in nude mice. Treatment with Ad-RB94 and/or ionizing radiation (IR) was carried out both in vitro and in vivo with Ad-LacZ control vector and blank control. Cell viability, cell cycle distribution, cell apoptosis, tumor growth and transfected gene expression were evaluated and tumor degeneration was analyzed. The data of quantification real-time PCR assays and immunohistochemistry staining using RB antibody indicated that RB94 was efficiently transfected into Kyse150 cells. In vitro, data of cell growth assay indicated that treatment with Ad-RB94 improved radiation treatment of Kyse150 cells. Tumor xenograft studies, pathological analysis of H.E. staining and Ki67 staining suggested transfecting RB94 enhanced tumor regression induced by radiation treatment in vivo. In addition, data of Annexin V, TUNEL and cell cycle distribution assays proposed combination treatment effectively induced cell apoptosis and cell cycle arresting in G2/M phase. In conclusion, transferring RB94 gene by the adenoviral vector enhances radiation treatment of ESCC.     

Combination of radiotherapy and adenovirus-mediated p53 gene therapy for MDM2-overexpressing hepatocellular carcinoma

The p53 gene plays a determinant role in radiation-induced cell death and its protein product is negatively regulated by MDM2. We investigated whether adenovirus-mediated modified p53 gene transfer, which blocks p53-MDM2 binding, is effective for radiation-induced cell death in hepatocellular carcinoma (HCC) at different MDM2 cellular levels. Human hepatocellular carcinoma cell lines expressing MDM2 at low levels (Huh7) and high levels (SK-Hep1) were used. Ad-p53 and Ad-p53vp are replication-deficient adenoviral vectors containing human wild-type or modified p53, respectively. The anti-tumor effect was highest for Ad-p53 + radiotherapy (RT) in the low-level MDM2 cells, whereas this effect was highest for Ad-p53vp + RT in the MDM2-overexpressing cells. In Huh-7 cells, Ad-p53 + RT decreased cell viability (32%) in vitro and inhibited tumor growth (enhancement factor, 1.86) in vivo. Additionally, p21 expression and apoptosis were increased. In contrast, in SK-Hep1 cells, Ad-p53vp + RT showed decreased cell viability (51%) in vitro and inhibition of tumor growth (enhancement factor, 3.07) in vivo. Caspase-3 expression and apoptosis were also increased. Adenovirus-expressing modified p53, which blocks p53-MDM2 binding, was effective in killing tumor cells overexpressing MDM2. Furthermore, the combination strategy for disruption of the p53-MDM2 interaction with RT demonstrated enhanced anti-tumor effects both in vitro and in vivo.     

外源性p21（waf1）基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响

目的：探讨外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖的影响。方法：用脂质体介导的方法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染人胃癌细胞系BGC-823,分为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组及未转染组三个组别。应用实时荧光定量RT-PCR、Westernblot免疫印迹分别在基因和蛋白两个水平检测各组p21的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞DNA周期变化,所有数据进行统计学分析。结果：p21waf1转染组p21waf1mRNA和p21蛋白高表达（P〈0.01）;p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度明显低于空载体组和未转染组（P〈0.01）;流式细胞仪观察到p21waf1转染组细胞的G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组（P〈0.01）,S期比例显著低于空载体组和未转染组（P〈0.01）,并出现凋亡峰。结论：p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡,可能为胃癌的基因治疗提供一条新的途径。