帕米磷酸二钠及埃本磷酸二钠对前列腺癌细胞系DU145、LNCaP体外生长的抑制作用

目的　观察帕米磷酸二钠 (PAM )及埃本磷酸二钠 (IBN )对体外培养的前列腺癌细胞系DU 14 5、LNCaP生长的抑制作用 ,探讨双磷酸盐类药物抑制前列腺癌细胞生长的机制。方法　采用MTT法检测不同剂量的PAM、IBN对DU 14 5、LNCaP细胞系生长的影响 ,并计算 2种药物的IC50 值 ,应用流式细胞仪检测DNA含量以探讨双磷酸盐类药物的作用机制。结果　PAM、IBN对前列腺癌DU 14 5、LNCaP细胞系的生长均有抑制作用 ,抑制效应与药物剂量、作用时间成正比 ,15 0 μg/mlPAM和 10 0 μg/mlIBN作用 72h后 ,2种细胞的生存率均低于 40 .0 0 % (P <0 .0 5 )。根据IC50 值可知IBN对前列腺癌细胞的抑制作用比PAM强。结论　PAM、IBN对体外生长的前列腺癌细胞系DU 14 5、LNCaP产生剂量、时间依赖性的抑制作用 ,其抑制细胞的作用机制为促进癌细胞凋亡和干扰DNA合成。     

CMVE-PEG3启动子在前列腺癌DU145细胞中的活性鉴定

[目的]比较CMVE-PEG3p、PEG-3启动子在DU145细胞中的启动活性,为前列腺癌靶向性基因治疗提供依据.[方法]用PCR法扩增CMV增强子、PEG-3启动子;在真核表达质粒pShuttle-EGFP基础上分别构建2种启动子调控的、以绿色荧光蛋白为目的基因的真核表达质粒pShuttle-CMVE-PEG3p-EGFP、pShuttle-PEG3p-EGFP.将重组质粒用脂质体分别转染前列腺癌DU145细胞和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1,72h后用Imagepro-Plus6.0分析2种启动子在相同时间内启动绿色荧光蛋白的表达水平.[结果]重组质粒在DU145细胞中观察到了绿色荧光,在RWPE-1细胞中无绿色荧光.pShuttle-CMVE-PEG3p-EGFP质粒在DU145细胞中表达强于pShuttle-PEG3p-EGFP.2种质粒在DU145细胞中的荧光强度(IOD)分别为246.22、130.93.[结论]所克隆的CMVE-PEG3p启动子和PEG-3启动子在前列腺癌DU145细胞中均表现出肿瘤特异性,其中CMVE-PEG3p启动子具有更强的启动效应,有望开发成为前列腺癌靶向性基因治疗的工具.     

PEG-3启动子在前列腺癌细胞DU145中的活性鉴定

目的探讨PEG-3启动子在前列腺癌细胞DU145中的启动活性。方法用PCR法扩增PEG-3启动子;在真核表达质粒pShuttle-CMVp-EGFP基础上构建PEG-3启动子调控的、转录绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒pShuttle-PEG3p-EGFP。将2种质粒(pShuttle-PEG3p-EGFP和pShuttle-CMVp-EGFP)用脂质体分别转染前列腺癌细胞DU145和人正常前列腺上皮细胞RWPE-1,72 h后在荧光显微镜下用Im-agepro-Plus 6.0分析2种启动子启动绿色荧光蛋白基因的转录活性。结果重组质粒在前列腺癌细胞DU145中观察到了绿色荧光,在人正常前列腺上皮细胞RWPE-1细胞中无绿色荧光。pShuttle-PEG3p-EGFP和pShuttle-CMVp-EGFP 2种质粒在前列腺癌细胞DU145中的荧光强度分别为403.50、130.93。结论所克隆的PEG-3启动子表现出较强的肿瘤特异性,在前列腺癌细胞DU145中有一定的启动活性,可望开发成为肿瘤靶向性基因治疗工具。     

miR-17-92基因簇增强前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂的耐药性

背景与目的:miR-17-92基因簇与多种疾病的发生密切相关,其在肺癌、肝癌、胃癌和前列腺癌等多种肿瘤细胞中均高表达.本研究利用慢病毒包装系统建立稳定高表达miR-17-92基因簇的DU145细胞株,探讨miR-17-92基因簇对前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂耐药性的影响.方法:构建高表达miR-17-92基因簇的表达载体,转染DU145细胞株,同时转染空载体作为对照,并用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)进行鉴定.用xCELLigence系统监测细胞的迁移、侵袭能力及顺铂处理后的生长情况;通过划痕实验观察细胞的迁移情况;采用蛋白[质]印迹法(Western blot)、凝胶酶谱实验和RTFQ-PCR检测相关蛋白质和基因的表达以探讨miR-17-92增强DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂耐药性的相关机制.结果:DU145-miR-17-92细胞迁移速率和侵袭能力高于DU145-control细胞(P<0.01).DU145-miR-17-92细胞中整合素β1的蛋白质表达水平和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)的活性显著高于DU145-control细胞.顺铂处理后,DU145-miR-17-92细胞的生长速度自12 h起快于DU145-control细胞并呈顺铂耐药性(P<0.01).细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)在DU145-miR-17-92细胞中呈现持续高水平磷酸化,顺铂处理后,其磷酸化水平无明显变化.DU145-miR-17-92细胞中切除修复互补交叉基因1(excision repair cross complementing1,ERCC1)的mRNA和蛋白质表达水平显著高于DU145-control细胞.结论:高表达miR-17-92增强了DU145细胞的迁移、侵袭能力,其机制与整合素β1的表达上调及MMP-9活性增强有关.此外,高表达miR-17-92增强了DU145细胞对顺铂的耐药性,该过程与ERK1/2的磷酸化水平增加和ERCC1的表达水平上调相关.     

miRNA141表达的调控对人前列腺癌DU145细胞恶性生物行为的影响

目的：研究microRNA-141（miR-141）表达的调控对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移等恶性生物学行为的影响及其作用机制。方法：利用脂质体Lipofectamine2000将miR-141 mimics（miR-141 up组）和miR-141 inhibi‐tiors（miR-141 down 组）分别转染至人前列腺癌DU145细胞中,同时设置未转染组（Control组）和miRNA无义序列转染组（NC组）。qPCR检测转染前后各组DU145细胞中miR-141表达变化,MTT方法检测各组DU145细胞的增殖活力和对顺铂（DDP）作用敏感性变化,流式细胞术检测各组DU145细胞周期和顺铂作用下凋亡率变化,Transwell方法检测各组细胞侵袭和迁移能力的变化,Western blotting检测各组细胞中VEGF、EGFR蛋白表达量变化。结果：与Control组和NC组相比,miR-141 down组DU145细胞中miRNA-141表达水平下降为（0.18±0.08）,其细胞增殖活力显著下降而对DDP敏感性显著上升、细胞周期被阻滞于G0+G1期而细胞凋亡率显著上升至（46.67±5.86）%、细胞侵袭率和迁移率分别显著下降至（44.34±8.32）%和（57.73±6.19）%、VEGF和EGFR相对表达量分别下降至（0.47±0.06）和（0.36±0.06）（上述各指标分别P<0.05或P<0.01）。miR-141 up组DU145细胞中miR‐NA-141表达水平上升为（4.23±0.53）,其细胞增殖活力显著上升而对DDP敏感性显著下降、细胞周期提前进入S和G2期而细胞凋亡率显著下降至（18.77±4.24）%、细胞侵袭率和迁移率分别显著上升至（89.94±6.34）%和（94.44±5.84）%、VEGF和EGFR相对表达量分别上升至（0.89±0.07）和（0.73±0.06）（上述各指标分别P<0.05或P<0.01）。结论：miR-141在前列腺癌DU145细胞中发挥促癌因子作用,其下调表达能够显著抑制DU145细胞增殖活力、周期、侵袭与迁移,而促进对DDP的敏感性和细胞凋亡,其机制可能与其抑制VEGF和EGFR蛋白表达有关。     

环王巴明诱导DU145细胞凋亡的机制研究

目的:研究环王巴明诱导DU145细胞凋亡作用及其对Gli-1和Bcl-2 mRNA表达的影响,探讨环王巴明诱导DU145细胞凋亡的机制.方法:不同浓度环王巴明处理DU145细胞后,吖啶橙染色,荧光显微镜下观察细胞形态变化.流式细胞术观察细胞凋亡率变化,RT-PCR检测5、10μmol/L环王巴明作用72h后的实验组和对照组Gli-1、Bcl-2 mRNA表达水平差异.结果:当环王巴明浓度大于5μmol/L作用72h后,荧光显微镜下可见细胞核固缩或碎裂,核仁变形等典型的凋亡形态学改变.环王巴明5μmol/L组Gli-1、Bcl-2mRNA表达减弱,但同对照组差异无统计学意义(P>0.05),与空白及DMSO对照组相比10μmol/L环王巴明可以显著下调Gli-1、Bcl-2 mRNA表达(P<0.01).结论:环王巴明可诱导人前列腺癌DU145细胞株凋亡,其作用机制可能与下调Gli-1和Bcl-2mRNA表达,活化细胞凋亡的线粒体途径有关.     

KAI1基因对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用

目的研究KAI1基因对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用。方法应用脂质体法将pCMV-KAI1质粒转染人高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,免疫印迹方法检测蛋白表达;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、平板克隆形成实验、体外黏附及侵袭力实验判断细胞增殖能力及黏附、侵袭力的变化。流式细胞术检测细胞生长周期的变化。结果获得了稳定表达KAI1基因的MDA- MB-231乳腺癌细胞克隆。MTT法显示,转染KAI1基因组的集落形成率(25.33%±2.36%)较转染前(43.17%±2.75%)明显降低(P<0.05)。体外黏附及侵袭力实验表明,转染组的细胞黏附侵袭能力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,转染KAI1后,G_0/G_1期细胞数量增高,从36.78%±0.61%升高至64.00%±7.56%;G_2/M期数量降低,由17.88%±0.76%降至7.63%±0.60%,差异有统计学意义。结论KAI1基因可以抑制乳腺癌细胞的增殖黏附和侵袭能力,并可能通过调节细胞周期来影响细胞的增殖。     

外源性Egr—1基因表达对食管癌细胞株Eca109细胞生长的影响

目的：检测Egr-1蛋白在食管癌细胞株Eca109中的表达。方法：采用免疫细胞化学检测Egr-1蛋白在Eca109细胞中的表达,用脂质体基因转染法将真核表达载体PCMV－Egr-1质粒导入Eca109细胞,经Western blot和免疫细胞化学检测Egr-1蛋白在转染的Eca109细胞中呈高表达。结果Eca109细胞的Egr-1蛋白表达阴性,当导入外源性Egr-1基因后,Egr-1捕达阳性,表达Egr-1蛋白的Eca109的细胞形态上发生明显的的变化,表现为细胞变偏,呈散在生长,结论Egr-1蛋白的表达在一定程度上能抑制Eca109细胞生长。     

低氧对人前列腺癌DU145细胞c-met表达及其侵袭力影响的研究

目的:探讨低氧对前列腺癌DU145细胞c-met表达及侵袭力的影响.方法:将DU145细胞分为常氧组和低氧组,分别置于常氧(37℃、5%CO2、20%O2)和低氧(37℃、5%CO2、1%O2)条件下培养6、12、24和36 h,采用蛋白质印迹法及RT-PCR技术分别检测c-met蛋白及mRNA相对表达量,采用Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭力.结果:常氧及低氧6、12、24和36 h状态下DU145细胞c-met蛋白及mRNA的相对表达量依次升高,常氧组与低氧6、12、24和36 h组c-met mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义,P＜0.01;常氧组与低氧6 h组c-met蛋白的相对表达量比较差异有统计学意义(P＜0.05),常氧组与低氧12、24和36 h组c-met蛋白的相对表达量比较差异有统计学意义,P＜0.01;在低氧6～36 h,c-met蛋白及mRNA的相对表达量组间比较差异有统计学意义,P＜0.01;低氧6、12、24和36 h组侵袭细胞数比常氧组明显增多,差异有统计学意义(P＜0.05),而且随着低氧时间延长,侵袭细胞数逐渐增多,组间比较差异有统计学意义,F=25.396,P＜0.01;c-met蛋白表达的变化与细胞侵袭力的变化呈正相关,r=0.984,P＜0.01.结论:低氧环境可使DU145细胞c-met蛋白及mRNA表达明显增加,使细胞的侵袭力增强,其侵袭力的增强可能与c-met表达水平增高有密切关系.     

长链非编码RNA TUG1通过吸附miR-145对XB1702细胞放射敏感性影响

目的 研究长链非编码RNA TUG1对宫颈癌细胞放射敏感性的影响,并探讨其作用机制。方法 运用qRT-PCR法检测宫颈癌细胞XB1702及正常子宫内膜基质细胞ESC中TUG1和miR-145表达。实验分为转染si-NC组、转染si-TUG1、转染si-NC并照射、转染si-TUG1并照射、共转染si-TUG1和anti-miR-NC和共转染si-TUG1和anti-miR-145组。用脂质体法转染至XB1702细胞。克隆形成实验检测各组细胞存活分数,流式细胞术检测各组细胞凋亡。双荧光素酶报告基因检测各组细胞荧光活性。结果 与ESC细胞相比,XB1702细胞中TUG1表达升高,miR-145表达降低;沉默TUG1可显著提高XB1702细胞存活分数、促进凋亡,增强放射敏感性。TUG1可靶向调控miR-145表达,抑制miR-145可逆转沉默TUG1对XB1702细胞的增殖抑制、凋亡促进及增敏作用。结论 沉默长链非编码RNA TUG1可增强宫颈癌细胞放射敏感性,其机制可能与靶向miR-145有关,将可为宫颈癌放疗提供靶点。     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.     

PC-1基因表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响

背景与目的:PC-1基因在雄激素非依赖和高转移能力的前列腺癌C4-2细胞中高表达,在雄激素依赖及不转移的前列腺癌LNCaP细胞中低表达。本实验旨在研究PC-1对前列腺癌细胞迁移能力的影响。方法:构建PC-1稳定高表达的LNCaP细胞株和反义核酸调低内源性PC-1表达的C4-2细胞株。利用体外迁移系统检测PC-1表达对LNCaP和C4-2细胞迁移运动能力的影响。结果:体外迁移实验表明稳定转染提高PC-1的表达水平并未使LNCaP迁移细胞数增多(P>0.05),而反义核酸降低PC-1表达则使C4-2迁移细胞数降低(P<0.05)。PC-1蛋白水平升高不能提高LNCaP细胞迁移能力,但降低内源性PC-1表达则使C4-2细胞迁移能力明显降低。结论:PC-1可能在前列腺癌细胞侵袭过程中起一定作用。     

KAI1基因对乳腺癌细胞生物学特征的影响

目的:研究稳定转染外源性KAI1基因对人乳腺癌细胞体外生物学特性的影响。方法:应用脂质体将pCMV-KAI1质粒转染入人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,免疫印迹方法检测蛋白表达,分别利用MTT法,体外粘附及侵袭力实验判断KAI1基因对细胞增殖能力及粘附,侵袭力的影响,并利用ELISA法检测转染前后游离组织间粘附因子-1(sICAM-1)的动态变化。结果:获得了稳定表达KAI1基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞克隆,并有KAI1蛋白的高表达。MTT法显示转染组的细胞增殖力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。体外粘附及侵袭力实验表明转染组的细胞粘附侵袭能力低于未转染组和转染空载体组(P<0.05)。转染后sICAM-1含量下降。结论:KAI1基因可抑制人乳腺癌细胞的恶性特征,并可能是通过影响一些粘附因子作用而抑制肿瘤细胞转移。     

基因沉默白介素8对激素非依赖前列腺癌干细胞的生物特性的影响

目的：探讨小干扰RNA沉默激素非依赖前列腺癌DU145细胞白介素8基因对肿瘤干细胞生物学特性及耐药性的影响。方法用不同剂量的小干扰RNA沉默激素非依赖前列腺癌DU145细胞IL-8基因,应用流式仪检测AL-DH阳性细胞比例的变化。采用悬浮细胞成球和克隆形成实验分别观察肿瘤干细胞自我更新和体外成瘤能力的变化。Annexin V-PE／7-AAD细胞凋亡双染试剂盒检测细胞凋亡率的变化,Western-blot法分析Akt蛋白的变化。结果 DU145细胞IL-8基因的沉默能降低肿瘤干细胞的比例,显著降低肿瘤干细胞悬浮细胞成球率和克隆形成率。多西他赛能显著抑制IL-8基因沉默DU145细胞的活性。 Western-blot显示Akt的磷酸化被显著抑制。结论 IL-8基因的沉默能显著抑制激素非依赖前列腺癌干细胞的自我更新和体外成瘤能力,增加该群细胞对多西他赛的化疗敏感性,同时显著抑制了Akt的磷酸化,这可能是IL-8基因沉默抑制该群细胞干细胞特性的作用机制之一。     

p16基因转染对肾癌细胞生物学特性的影响

[目的]探讨p16基因修饰后小鼠肾癌细胞体外生物学特性的变化。[方法]将携带p16基因的腺病毒体外转染小鼠肾癌Renca细胞,观察腺病毒对Renca细胞的转染效率以及p16基因修饰的Renca细胞体外生物学性质的改变。[结果]在多重感染度（MOI）值为50,转染时间为12h时,能够达到75%-80%的转染效率,并获得目的基因p16蛋白的高效表达。转染p16基因的Renca细胞生长明显受到抑制,Fas和MHCⅠ类抗原表达增高,细胞周期分析显示细胞阻滞于C0/C1期的比例明显高于对照组（85%比62%）。[结论]小鼠肾癌细胞中外源p16基因的表达不仅直接抑制肿瘤细胞的恶性增殖,还可诱导细胞发生凋亡,同时能增强肿瘤细胞的自身免疫原性。     

野生型p53基因对人胆囊癌细胞生长及致瘤性的抑制作用

目的:研究野生型p53(wtp53)基因对人胆囊癌细胞生长及致瘤性的影响.方法:应用免疫细胞化学染色、PCR产物直接测序方法分析细胞系遗传背景,在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53,导入GBC-SD细胞中.用G418筛选,建立转染克隆细胞系.以PCR,RT-PCR和蛋白印迹证实外源p53基因的整合与表达;以细胞生长曲线和集落形成实验反映细胞增殖状况;以裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响.结果:GBC-SD细胞P53蛋白过表达;直接测序发现第5外显子126位密码子存在TAC→AAC的碱基突变.外源p53基因已整合入转染后的GBC-SD细胞并获稳定表达.表达外源wtp53的GBC-SD-wtp53细胞生长速率减慢、集落形成能力下降及裸鼠致瘤性受到显著抑制.结论:野生型p53基因可有效抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体内、外生长.     

HPV16E7基因沉默对宫颈癌细胞系CaSki细胞增殖的影响

[目的]探讨脂质体转染HPVl6E7siRNA对人宫颈癌CaSki细胞增殖的影响。[方法]人工合成抑制HPVl6E7基因的siRNA片段,通过脂质体转染到CaSki细胞内,显微镜下观察其形态学变化;流式细胞术检测各组细胞周期变化;RT-PCR检测HPVl6E7mRNA的表达;Westernblot检测HPVl6E7蛋白表达。[结果]转染siRNA后的CaSki细胞,细胞增殖受到显著抑制．HPVl6E7mRNA表达显著下降,HPVl6E7蛋白水平显著下降。[结论]应用RNA干扰靶向抑制HPVl6E7基因可以显著抑制CaSki细胞增殖。