TGF-β1通过上调Shh 信号诱导大鼠脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化

目的 探讨TGF-β1在诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞中对Shh信号的影响。方法 新生24 h SD大鼠脑膜原代成纤维细胞经Ⅳ型胶原酶提取纯化。原代脑膜成纤维细胞随机分为3个组：分别为空白对照组、10 ng/mL TGF-β1处理组（TGF-β1组）、10 ng/mL TGF-β1联合20 μmol/L TGF-β1受体抑制剂SB-431542组(TGF-β1+SB组)。各组细胞在药物处理前均用无血清培养基培养24 h后换用加入了药物的DMEM/F12完全培养基处理72 h。采用CCK-8法检测各实验组成纤维细胞的增殖能力;细胞划痕实验检测各实验组成纤维细胞的迁移能力;免疫荧光法检测各实验组纤维连接蛋白（Fn）的表达;Western blotting检测各实验组Fn、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Shh蛋白的表达;q-PCR检测各实验组细胞Shh mRNA的表达。结果 TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的增殖（P<0.05）;TGF-β1可促进原代脑膜成纤维细胞的迁移（P<0.05）。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并增加Fn的分泌（P<0.05）。TGF-β1处理后可上调Shh蛋白和mRNA的表达（P<0.05）,TGF-β1受体抑制剂SB-431542则可抑制TGF-β1引起的原代脑膜成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化并减少纤维连接蛋白的分泌（P<0.05）。结论 TGF-β1可通过上调Sonic Hedgehog信号通路中Shh蛋白的表达,诱导脑膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。     

bFGF反义寡核苷酸对大鼠肺成纤维细胞增殖信号通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸(AODN)对大鼠肺成纤维细胞增殖、转化信号通路的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞,分为4组:对照组(未转染肺成纤维细胞);TGF-β1组(未转染肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+AODN组(转染AODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+RODN(正义寡核苷酸)组(转染RODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激)。每组设3复孔,并作细胞爬片,镜下计数肺成纤维细胞数量,绘制生长曲线。MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率。免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。通过ELISA法检测培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量。用RT-PCR法分析肺成纤维细胞Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果:1细胞计数显示:TGF-β1+RODN组各时段成纤维细胞的数目均较对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组明显增多(P<0.05);TGF-β1+AODN组中成纤维细胞增殖数比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。2MTT结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞光密度值明显比TGF-β1组减低(P<0.05)。3免疫细胞化学染色结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞与对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组比较,α-SMA染色的平均光密度值(IOD)明显增加(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞α-SMA染色的平均光密度值(IOD)比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。4 ELISA法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。5RT-PCR法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显比TGF-β1组明显减低(P<0.05);TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad7mRNA表达明显低于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad7 mRNA表达比TGF-β1组明显增加(P<0.05)。结论:bFGF反义寡核苷酸可抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及胶原合成,bFGF反义寡核苷酸可能通过下调TGF-β1-Smad信号通路来发挥作用。     

Notch信号通路对肌成纤维细胞转化中α-SMA表达变化的影响

目的 探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号后,肌成纤维细胞标志因子α-SMA表达的变化,及Notch信号在肌成纤维细胞转化中的作用.方法 采用胰酶消化法,从新出生2～3 d的SD大鼠肺组织中分离肺成纤维细胞,波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学法鉴定培养至第3代的成纤维细胞的纯度,再将细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+DAPT组;TGF-β1组及TGF-β1+DAPT组加入5 ng/mL的TGF-β1诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,TGF-β1+DAPT组同时加入500 nmol/L的DAPT抑制Notch信号的表达;分别采用RT-PCR法检测α-SMA的mRNA表达变化,Western-blot法检测α-SMA蛋白的表达变化;采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验.结果 Vimentin免疫细胞化学:几乎100％细胞胞浆内可见棕黄色颗粒及条纹;TGF-β1组α-SMA的mRNA和蛋白的相对吸光度值分别为(0.8510.027)和(0.7850.020),均较对照组(0.3950.018)和(0.3910.022)明显升高;TGF-β1+DAPT组的mRNA和蛋白的相对吸光度值分别为(0.3540.029)和(0.3970.016),均较TGF-β1组显著下降,但与对照组比较无明显差异.结论 TGF-β1可以诱导肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,DAPT可以阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,进而抑制肺纤维化.     

CSD肽对肺成纤维细胞细胞外基质及Smad信号表达的影响

目的研究CSD肽（CSD-p）对转化生长因子β1（TGF-β1）刺激下人胚肺成纤维细胞的细胞外基质及Smad信号表达的影响。方法体外培养人胚肺成纤维细胞,分为4组：对照组（无TGF-β1处理）、TGF-β1处理组、CSD-p处理组、TGF-β1及CSD-p联合处理组。RT-PCR测定各组窖蛋白1mRNA的表达;Western blot检测各组窖蛋白1、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原Ⅰ、p-Smad2、p-Smad3及Smad7蛋白的表达。结果 TGF-β1刺激人胚肺成纤维细胞后,窖蛋白1的mRNA和蛋白表达较对照组明显降低（mRNA：0.404±0.027比1.540±0.262;蛋白：0.278±0.054比1.279±0.085;P〈0.01）。经TGF-β1刺激,人胚肺成纤维细胞的胶原Ⅰ（1.127±0.078比0.234±0.048）、α-SMA（1.028±0.058比0.295±0.024）,p-Smad2（1.162±0.049比0.277±0.014）、p-Smad3（1.135±0.057比0.261±0.046）蛋白表达增加（P〈0.01）;Smad7表达较对照组明显降低（0.379±0.004比1.249±0.046,P〈0.001）。与TGF-β1处理组比较,CSD肽明显抑制TGF-β1诱导的胶原Ⅰ（0.384±0.040）、α-SMA（0.471±0.071）、p-Smad2（0.618±0.096）、p-Smad3（0.461±0.057）蛋白表达;上调Smad7的蛋白表达（0.924±0.065比0.379±0.004）。结论 CSD肽下调TGF-β1刺激下人胚肺成纤维细胞的胶原Ⅰ及α-SMA蛋白的表达,可能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路激活,提示使用CSD肽增加窖蛋白1功能可能对肺纤维化具有一定的干预作用。     

白血病抑制因子对肾间质成纤维细胞活化的影响

目的 研究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)对肾间质成纤维细胞活化的干预作用.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞,分对照组、转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理组及TGF-β1和LIF共处理组,电镜下观察细胞形态变化,通过RT-PCR及Western blot检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达的改变,双抗体夹心ABC-ELISA检测细胞上清Ⅰ型胶原.结果 TGF-β1引起成纤维细胞激活,产生形态学改变,α-SMA表达增高(P<0.01),Ⅰ型胶原产生增加(P<0.01).与TGF-β1处理组相比,LIF干预组形态学改变不明显,LIF能干预TGF-β1引起大鼠肾间质成纤维细胞α-SMA表达和Ⅰ型胶原产生.结论 LIF可以抑制TGF-β1引起的肾间质成纤维细胞激活.     

β-catenin蛋白敲除对肺成纤维细胞活性影响的实验研究

目的 探讨β-catenin蛋白敲除对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞（CCC-REPF-1）活性的影响及其机制.方法 体外培养大鼠肺成纤维细胞（CCC-REPF-1）,应用CCK-8法、Western blot、RT-PCR技术检测细胞增殖、活性及功能表达,进行统计学检验.结果 TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组CCK-8吸光度OD值、α-SMA和Fn蛋白表达量、α-SMA、col Ⅰ、colⅢmRNA表达量明显高于正常细胞组,而E-cadherin蛋白表达量明显低于正常细胞组;F-TrCP-Ecad转染组上述值明显低于TGF-β1刺激组（P＜0.01）,E-cadherin蛋白表达量高于TGF-β1刺激组（P＜0.01）;TGF-β1刺激组、pcDNA3转染组比较无明显差异.结论 TGF-β1是促进肺成纤维细胞增殖、活化的重要细胞因子,β-catenin途径是TGF-β1发挥作用的重要信号通路,β-catenin蛋白敲除通过阻断该信号途径,阻止肺纤维化进程.     

GSK3β/eEF2K信号通过调控自噬参与肺成纤维细胞诱导分化

目的 探讨糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/真核延伸因子2激酶(eEF2K)在肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中的表达,以及对细胞自噬和纤维化的影响。方法 将L-929细胞(对照组)于适宜条件下培养48 h,加入5 ng/mL TGF-β1诱导其表型转化为肌成纤维细胞(TGF-β1组)。将空质粒、si-eEF2K及si-GSK3β转染肌成纤维细胞,培养48 h后采用免疫荧光染色法检测p-eEF2K和α-SMA蛋白表达情况,蛋白质印迹法检测各组eEF2K、p-eEF2K、GSK3β、P62及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果 与对照组相比,TGF-β1组细胞p-eEF2K、GSK3β蛋白和α-SMA蛋白表达显著增加(P<0.05);转染si-eEF2K及si-GSK3β后,L-929细胞p-eEF2K/eEF2K表达下降(P<0.05),P62和LC3-Ⅱ/Ⅰ表达水平增加(P<0.05),α-SMA蛋白表达降低(P<0.05)。结论 GSK3β/eEF2K信号可能通过降低自噬活性促进肺成纤维细胞向肌纤维细胞的表型转化,促进细胞纤维化进程。     

PTEN抑制增生性瘢痕成纤维细胞转分化作用及其机制

目的观察染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)编码蛋白对TGF-β1刺激下瘢痕成纤维细胞转分化的抑制作用及其机制。方法用重组PTEN腺病毒转染体外培养的人瘢痕成纤维细胞,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;将实验分为对照组、PTEN转染组、空载体转染组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),RT-PCR和Western blot分别检测对照组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN mRNA和蛋白表达;Western blot检测各组中α-SMA、Akt、p-Akt表达水平。结果 PTEN基因转染瘢痕成纤维细胞36h后可见明显绿色荧光蛋白表达,PTEN转染组PTEN mRNA及蛋白的表达明显升高,与对照组及空载体转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而p-Akt和α-SMA的表达明显下降(P<0.05);TGF-β1组α-SMA表达较对照组明显升高,同时伴有p-Akt表达上升,与对照组、PTEN转染组、PTEN+TGF-β1组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);空载体转染组与对照组相比,p-Akt、α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);空载体+TGF-β1组与TGF-β1刺激组相比,p-Akt、α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。各组细胞的Akt表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TGF-β1可促进PI3K/Akt通路活化,使瘢痕成纤维细胞α-SMA表达升高,促进其转分化;空载体转染对p-Akt、α-SMA的表达无明显影响,高表达PTEN可使瘢痕成纤维细胞α-SMA的表达明显降低,并且可拮抗TGF-β1对瘢痕成纤维细胞的转分化作用,其机制可能是抑制PI3K/Akt通路活化。     

补肾活血方对人胚肺成纤维细胞中IL-17A的影响

目的 探讨补肾活血方对人胚肺成纤维细胞的作用机制.方法 应用TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞,将实验细胞分为空白组(A组),TGF-β1造模组(B组),TGF-β1处理+最佳浓度含药血清干预1 h组(C组),TGF-β1处理+shRNA-IL-17A组(D组),TGF-β1处理+最佳浓度含药血清干预1 h+IL-17A...     

过表达LncRNA GAS5对SD大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响

目的 应用长链非编码RNA GAS5 (LncRNA GAS5)过表达质粒(pEGFP-C1-GAS5)转染SD大鼠心肌成纤维细胞,观察其对心肌成纤维细胞活化增殖的影响.方法 提取SD大鼠心肌成纤维细胞,转化生长因子β1 (TGF-β1)刺激其增殖,分为pEGFP-C1-GAS5组、阴性对照组和空白对照组,应用LncRNA GAS5基因的过表达质粒 (pEGFP-C1-GAS5)通过脂质体瞬时转染细胞,48 h后收获细胞.采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测GAS5、Ⅰ型胶原前胶原(Col1A1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达,Western blot分析Col1A1和α-SMA蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖活力.结果 TGF-β1刺激心肌成纤维细胞后,qRT-PCR结果显示 LncRNA GAS5的表达量较正常组下降(P<0.05);与阴性对照组和空白对照组比较,转染了pEGFP-C1-GAS5的实验组,qRT-PCR结果显示实验组的GAS5表达均明显升高(P<0.05),同时α-SMA和Col1A1 mRNA表达显著降低(P<0.05);Western blot结果显示转染pEGFP-C1-GAS5的实验组α-SMA和Col1A1蛋白表达量均明显降低(P<0.05);MTT法检测结果表明在实验组心肌成纤维细胞的增殖活力低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05).结论 过表达LncRNA GAS5可显著降低心肌成纤维细胞的增殖活力,提示GAS5有抑制心肌成纤维细胞的活化增殖的作用,为以后进一步研究提供依据.     

贯叶连翘提取物对TGF—β1诱导肺成纤维细胞胶原合成影响的体外研究

目的研究贯叶连翘提取物对TGF-β1诱导离体肺成纤维细胞胶原合成的影响。方法离体成纤维细胞分别加入TGF-β1（10ng／ml）、贯叶连翘提取物（250mg／L）以及TGF-β1＋贯叶连翘提取物共培养48h,设为TGF-β1组,贯叶连翘组,TGF-β1贯叶连翘组,取DMEM培养液为对照组。应用SP免疫细胞化学法,免疫荧光细胞化学法及平均光密度（MOD）分析,观察在TGF-β1作用下,肺成纤维细胞α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达及贯叶连翘提取物的干预。结果TGF-β1诱导肺成纤维细胞α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性染色表达均显著高于对照组。贯叶连翘提取物干预48小时后,α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性染色表达明显下降,仍高于空白对照组。结论贯叶连翘提取物可抑制TGF-β1：诱导肺成纤维细胞转分化及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成。     

Peroxiredoxin-1基因沉默对转化生长因子β1促进肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的 探讨Peroxiredoxin-1 (Prx-1)基因沉默对转化生长因子β1(TGF-β1)促进肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原的影响及其作用机制.方法 体外培养肺成纤维细胞分为4组:对照组(0.4％血清),TGF-β1组(5 μg/L),TGF-β1+阴性转染组(5μg/L TGF-β1+阴性对照siRNA),TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组(5 μg/L TGF-β1 +Prx-1 siRNA).利用脂质体Lipo2000将阴性对照siRNA和Prx-1 siRNA分别转染到TGF-β1+阴性转染组和TGF-β1+Prx-1 siRNA转染组的肺成纤维细胞中,转染48 h后用于后续实验.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染后各组的Prx-1 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化Akt(p-Akt)及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白水平,2,7-二氯荧光素二乙酸检测活性氧(ROS)水平.结果 (1) Prx-1 siRNA转染肺成纤维细胞后,TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组的Prx-1 mRNA表达明显降低.(2)与对照组比较,TGF-β1组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及pAkt蛋白水平均明显增加(0.34±0.06 vs.0.58±0.06、0.42±0.05 vs.0.56±0.06、2 988±379 vs.4 315±580和0.29±0.05 vs.0.66±0.07,差异有统计学意义(P＜0.05).与TGF-β1组比较,TGF-β1+阴性转染组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及p-Akt水平无明显变化(P＞0.05),但TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及p-Akt蛋白水平均进一步增高(0.58±0.06 vs.0.79±0.09、0.56±0.06 vs.0.77±0.08、4 315±580 vs.5 841±782和0.66±0.07 vs.0.93±0.15,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞生成ROS,并由此促进Akt的激活和肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原;而沉默Prx-1基因可激活ROS/Akt通路,从而有助于TGF-β1促进肺成纤维细胞合成胶原.     

Snail介导的肺上皮间质转化在肌成纤维细胞活化中的作用

目的 探讨核转录因子Snail介导的肺上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在肌成纤维细胞活化中的作用。方法 培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（MLE-12）并利用转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）刺激获得EMT模型,应用RT-qPCR检测上皮标志物E钙粘蛋白（E-cadherin,CDH1）、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、核转录因子Snail mRNA表达变化。建立MLE-12与小鼠胚肺成纤维细胞（NIH-3T3）共培养体系,应用RT-qPCR检测NIH-3T3的α-SMA、Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ α1,COL1A1）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ α1,COL3A1）mRNA表达。利用Snail-shRNA转染MLE-12,应用RT-qPCR、Western blotting检测Snail mRNA和蛋白质表达。建立慢病毒转染的MLE-12与NIH-3T3共培养体系,应用RT-qPCR检测NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表达。采用单因素方差分析及最小显著差法判断结果差异是否具有统计学意义。结果 加入TGF-β1刺激48 h后,RT-qPCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组的CDH1 mRNA的表达下调、α-SMA和Snail mRNA的表达上调（P<0.05）;共培养体系中,RT-qPCR结果显示,与TGF-β1和MLE-12组相比,加入TGF-β1刺激的MLE-12引起下室NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表达上调,且上调程度高于TGF-β1和MLE-12的单独作用（P<0.05）;慢病毒转染后,与阴性对照病毒组相比,Snail慢病毒干扰组Snail的mRNA和蛋白质表达均明显下调（P<0.05）;分别用阴性对照病毒和Snail慢病毒转染MLE-12后与NIH-3T3建立共培养体系,RT-qPCR结果显示,与TGF-β1+阴性对照病毒组相比,TGF-β1+Snail慢病毒转染组下室NIH-3T3的α-SMA、COL1A1、COL3A1 mRNA表达上调程度降低（P<0.05）。结论 Snail介导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT可引起肌成纤维细胞活化,敲减Ⅱ型肺泡上皮细胞的Snail基因可抑制成纤维细胞活化为肌成纤维细胞。提示Snail介导的肺上皮间质转化在肌成纤维细胞活化中发挥重要作用。     

成纤维细胞激活蛋白在小鼠肺纤维化模型中的表达

目的探讨成纤维细胞激活蛋白（FAP）在实验性小鼠肺纤维化组织中的表达,及其与α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）之间的相互关系。方法气管内滴入博莱霉素（7mg/kg）制备肺纤维化模型,采用免疫组化技术检测小鼠肺纤维化组织中FAP、α-SMA和TGF-β1的表达。结果正常肺组织无FAP表达;纤维化组FAP表达于细支气管和大血管周围的成纤维细胞,成纤维细胞灶中FAP、α-SMA和TGF-β1表达部位相似,但FAP比α-SMA的表达更广泛,比TGF-β1的表达更强。FAP、α-SMA和TGF-β1与小鼠肺纤维化程度均呈正相关（r值分别为0.795、0.766和0.628,P〈0.01）,且FAP与TGF-β1的表达呈正相关（r=0.706,P〈0.01）。结论 FAP特异性表达在小鼠肺纤维化组织的成纤维细胞灶中,与肺纤维化程度有关。FAP与TGF-β1可能在肺纤维化形成中起协同作用。     

转化生长因子β1诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转分化的机制研究

目的:探讨TGF-β1诱导皮肤成纤维细胞(FB)向肌成纤维细胞转分化的可能途径和调控机制.方法:将野生型和Smad3基因敲除(KO)型小鼠皮肤FB分为9组:野生型FB组、野生型FB TGF-β1组、野生型FB SB431542组、野生型FB SB431542 TGF-β1组、Smad3 KO FB组、Smad3 KO FB TGF-β1组、野生型FB SB203580 TGF-β1组、野生型FB PD98059 TGF-β1组和野生型FB SP600125 TGF-β1组.各组细胞经同步化处理后,直接以TGF-β1刺激或经上述各激酶抑制剂预处理后再以TGF-β1刺激.收集细胞,一部分以单细胞RT-PCR检测α-SMA阳性表达百分比,另一部分细胞抽提总RNA后采用实时荧光定量RT-PCR检测α-SMA的表达水平变化.结果:Smad3 KO组与SB431542组的α-SMA表达水平和阳性百分比显著升高(Smad3 KO FB组vs野生型FB组;野生型FB SB431542 TGF-β1组vs 野生型FB SB431542组;Smad3 KO FB TGF-β1组vs Smad3 KO FB组,P＜0.01),而SB203580组和SP600125组中α-SMA表达水平和阳性百分比升高的作用则被显著抑制(野生型FB SB203580 TGF-β1组、野生型FB SP600125 TGF-β1组vs 野生型FB TGF-β1组,P＜0.05).结论:在TGF-β1诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化过程中,Smad3途径介导抑制作用,而p38/MAPK、JNK/MAPK途径则介导正向调节作用.     

核因子I-C 降低皮肤成纤维细胞对TGF-β的敏感性

目的探讨核因子I-C（NFI-C）对血小板源性生长因子（PDGF）促进皮肤成纤维细胞表达TGF-β受体Ⅱ（TβRⅡ）作用的影
响。方法含有NFI-C序列的慢病毒转染人皮肤成纤维细胞（HFF-1）;根据细胞生长活性及转染效率筛选最佳转染复数（MOI）;
PDGF-BB刺激体外培养的HFF-1细胞、转染NFI-C的HFF-1细胞以及转染阴性病毒的HFF-1细胞,并设立转染NFI-C但不用
PDGF处理的细胞;以不做任何处理的HFF-1 细胞作为空白对照组;采用western blot、RT-qPCR测定各组细胞TβRⅡ的表达。
数据采用单因素方差分析、LSD-t及SNK-q检验对各组数据进行分析。结果慢病毒转染HFF-1最适MOI为50。PDGF处理的
HFF-1细胞表达TβRⅡ高于空白对照组（P<0.05）;在PDGF作用下,转染NFI-C的HFF-1细胞表达TβRⅡ低于未转染的细胞（P<
0.05）;阴性病毒无明显抑制作用（P>0.05）;单纯转染NFI-C的HFF-1细胞表达TβRⅡ与空白对照组无显著性差异（P>0.05）。结
论NFI-C能抑制PDGF对TβRⅡ的上调作用,降低皮肤成纤维细胞对TGF-β的敏感性。
     

Ac\|SDKP调节Rac1信号抑制皮肤肌成纤维细胞的转化和迁移

目的 研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)通过阻断小G蛋白Ras相关的C3肉毒素底物(Rac1)信号,抑制转化生长因子β1(TGF-β1)介导的皮肤肌成纤维细胞转化的机制。 方法 原代培养大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞,分为空白对照组、TGF-β1诱导组及Ac-SDKP预处理组。划痕实验检测细胞迁移能力,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Rac1蛋白的表达,Western-blot法检测α-SMA、血清应答因子(SRF)、心肌蛋白相关转录因子(MRTF-A)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Rac1蛋白的表达。 结果 细胞划痕实验显示,TGF-β1诱导组与空白对照组比较,细胞迁移至中央划痕区的距离明显增大,Ac-SDKP预处理组与TGF-β1诱导组比较,细胞迁移至中央划痕区的距离减小。免疫细胞化学法检测结果显示,TGF-β1诱导组α-SMA和Rac1的阳性表达较空白对照组增强,而Ac-SDKP预处理组可明显抑制α-SMA和Rac1的阳性表达。TGF-β1诱导组的α-SMA,SRF,MRTF-A,ColⅠ及Rac1蛋白表达均较空白对照组明显上调,Ac-SDKP预处理组的蛋白表达较TGF-β1诱导组下降(P<0.05)。 结论 Ac-SDKP能够阻断Rac1信号,抑制TGF-β1介导的皮肤成纤维细胞迁移能力的提高和肌成纤维细胞转化。     

囊素五肽对人肺成纤维细胞细胞外基质及转化生长因子β1／Smad信号通路的影响

目的观察囊素五肽（BP5）对转化生长因子β1（TGF-1）刺激的人肺成纤维细胞分泌的细胞外基质以及对转化生长一β1／Smad信号通路的影响,探讨囊素五肽抗肺纤维化的机制。方法HLF细胞分为阴性对照组、TGF- β1 刺激组、TGF-β1＋BP5药物干预组（三组均用TGF-β1刺激后分别使用不同浓度BP52．5、5及10μg／mL进行干预）。免疫荧光法测定细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,Westernblot方法检测collagen—Ⅰ、p-Smad2／3、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果TGF—β1刺激细胞经免疫荧光标记显示α-SMA阳性表达,说明人肺成纤维细胞在TGF-β1刺激下转化为肌成纤维细胞（MF）,TGF-β1刺激同时加BP5不同药物浓度组中,10μg／mL的BP5药物浓度能显著减少细胞增殖转化。经TGF-β1刺激后,人肺成纤维细胞collagen—Ⅰ[（1．402±0．158）比（0．605±0．367）]、p-Smad2／3[（1．457±0．111）比（0．815±0．039）]、p-Smad3[（1．320±O．147）比（0．623±O．128）]蛋白表达较刺激前表达明显增多（P〈0．01）,Smad7表达较对照组降低[（0．613±0．107）比（0．865±0．063）,P〈0．05）];与TGF-β1处理组相比,BP5可抑制由TGF-β1刺激人肺成纤维细胞引起的collagen—Ⅰ蛋白[（0．718±0．049）比（1．402±0．t58）]、p-Smad2／3[（0．696±0．031）比（1．457±0．111）]p-Smad3[（0．766±0．006）比（1．320±0．147）]表达上调（P均〈0．01）,而Smad7的蛋白表达明显增加[（1．237±0．173）比（0．614±0．107）,P〈0．05]。结论BP5可能通过抑制TGF—β1／Smads信号通路激活,下调TGF-β1刺激下人肺成纤维细胞的collagen-Ⅰ及d—SMA蛋白的表达,提示BP5可能对肺纤维化具有一定的干预作用。     

FUT8调控TGF-β1介导的肺成纤维细胞纤维化的机制

目的 探讨α-1,6岩藻糖基转移酶（FUT8）对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）增殖、迁移和纤维化的作用及可能机制。方法将24只C57/BL6小鼠随机分为对照组、博莱霉素组、sh-NC组和sh-FUT8组,应用Masson染色观察肺纤维化情况。细胞实验分别设置对照组：MRC-5正常培养;TGF-β1组：TGF-β1处理MRC-5;si-NC组：si-NC转染MRC-5后TGF-β1处理;si-FUT8组：siFUT8转染MRC-5后TGF-β1处理;Gal-3组：si-FUT8和pcDNA3.1-Gal转染MRC-5后TGF-β1处理。CCK-8和BrdU方法检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;RT-qPCR和Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SM A）、I型胶原蛋白（COLIA1）和细胞外基质纤维连接蛋白（FN）的表达水平。同时,免疫共沉淀检测了FUT8与半乳糖凝集素-3(Gal-3)的作用及沉默FUT8对FAK/Akt信号通路的调节。结果 沉默FUT8显著降低博莱霉素诱导的小鼠肺组织细胞外胶原沉积。沉默FUT8抑制TGF-β1介导的细胞增殖（186.81±6.29 ...