CIK的体外增殖及体内外杀瘤活性的实验研究

目的:从人骨髓造血前体细胞体外培养扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs),测定其表型及T细胞刺激活性.方法:采用Mini-MACS分离技术,从正常人骨髓、脐血分离CD34~ 造血干细胞,体外以重组hGM-CSF,hTNF-α,hIL-3诱导培养2周,流式细胞术检测扩增细胞的表面表型及细胞内IL-12的表达,体外同种混合淋巴细胞反应检测扩增DCs的T细胞刺激活性.结果:从正常人骨髓、脐血分离得到高纯度(>90%)的CD34~ 造血干细胞,经重组hGM-CSF,hTNF-α的共同诱导培养,扩增得到大量DCs,加人hIL-3可以进一步增加DCs产量;FACS检测表明,扩增的DCs表达HLA-DR,CD40,CD54,CD80,CD86分子,细胞内有hIL-12的P35,P40亚基的表达;与外周血单核细胞培养生成的DCs相比,由CD34~ 干细胞扩增的DCs具有更强的激发同种T细胞增殖的能力.结论:人CD34~ 干细胞体外经诱导培养,可以生成大量功能成熟的DCs,从而为进一步开展DCs的基础及临床研究打下了基础.     

肺癌胸腔积液树突状细胞培养与鉴别及其抗肿瘤作用的观察

目的:证实肺癌胸腔积液中存在树突状细胞(DCs)的前体细胞,体外培养可以获得成熟的DCs,并探讨DCs对自体癌细胞的杀伤作用.方法:通过Ficoll淋巴细胞分离液对15例肺癌患者的恶性胸腔积液进行密度梯度离心,以两步贴壁法分别获得DCs的前体细胞和自体癌细胞.前者加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhIL-4)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)培养.显微镜观察细胞形态,流式细胞仪鉴定DCs表型.MTT法检测DCs对自体癌细胞的杀伤作用.结果:体外培养9d后获得大量成熟的DCs,具有典型树突状形态,且高表达HLA-DR[(84.2±6.3)％]、CD80[(75.8±8.8)％]、CD83[(58.0±9.4)％]和CD86[(83.3±7.5)％];MTT法结果显示,DCs对自体癌细胞有较强的杀伤作用,当效靶比为20∶1时杀伤率为(50.62±7.51)％.结论:肺癌恶性胸腔积液中的DCs前体细胞经诱导培养后可转化为功能健全的成熟DCs,成熟的DCs对自体癌细胞有直接杀伤作用,为恶性胸腔积液的免疫治疗提供理论依据.     

恶性胸腔积液来源树突状细胞的纯化培养研究

[目的]建立体外恶性胸腔积液来源树突状细胞(DCs)的纯化方法,观察DCs的形态学.[方法]从肺癌患者胸腔积液中分离、纯化出DCs前体细胞,加入IL-4、GM-CSF、TNF-α诱导出DCs.用电镜和光镜观察培养的DCs,并用流式细胞仪检测DCs的表面分子.[结果]在体外诱导出恶性胸腔积液来源的功能健全的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态;高表达HLA-ABC、HLA-DR、CD86,较高表达CD80、CD54,也表达CD83,CD-la;当DCs体外培养到第48h时,表面分子的表达率相对较高.『结论]肺癌患者恶性胸腔积液来源的DCs经过纯化及48h的培养后,不仅在形态上成熟,而且高表达特异性表面分子.     

树突状细胞疫苗的制备及其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞对宫颈癌CaSki细胞的杀伤作用

目的:制备树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗并观察其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)对宫颈癌CaSki细胞的杀伤效应。方法:分离培养小鼠未成熟DCs,FCM检测小鼠未成熟DCs表面标志物CD40、CD86、主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)和CD11c;将已成功构建的携带人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16E6E7基因的重组腺病毒pAd-E6E7感染体外培养的小鼠未成熟DCs,提取CaSki细胞裂解物负载DCs,制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜下观察pAd-E6E7感染的小鼠未成熟DCs绿色荧光蛋白表达,Western印迹法检测E6蛋白的表达;DCs疫苗诱导产生CTLs后与CaSki细胞共培养,CCK8(cell countingkit8)法检测其对CaSki细胞的杀伤效应。结果:成功分离培养了小鼠未成熟DCs,并制备获得了HPV16E6E7特异性DCs疫苗。DCs疫苗诱导产生的CTLs对CaSki细胞具有杀伤作用,pAd-E6E7感染组对CaSki的杀伤效应明显高于CaSki细胞裂解物负载组及未处理DCs组(P<0.05)。结论:以携带HPV16E6E7基因的重组腺病毒感染DCs制备基因修饰的DCs疫苗,具有诱导CTLs体外杀伤子宫颈癌CaSki细胞的作用。     

人肺癌组织总RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的:探讨以人肺癌组织总RNA体外转染树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymptocyte,CTL)发挥特异性抗肿瘤免疫的作用.方法:10例肿瘤组织经免疫组化测定为CEA、MUC1双阳性.一步法提取肿瘤组织总RNA和10例正常肺组织RNA.采集患者外周血单个核细胞体外诱导未成熟DCs,电穿孔法转染肿瘤和肺组织RNA,刺激DCs成熟后,部分行流式细胞仪检测,部分用于体外诱导CTL.以原代培养的肿瘤细胞和肺上皮细胞作为靶细胞,定量乳酸脱氢酶法测定杀伤率.结果:体外培养的DCs形态典型,高表达CD86、CD80、CD40、HLA-DR和CD83.转染肿瘤组织RNA DCs的CEA和MUC1表达量为(20.53±3.64)%和(65.39±9.33)%,明显高于转染肺组织RNA的DCs[(0.78±0.39)%和(18.32±4.24)%],P＜0.01.肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL可产生针对肿瘤细胞的特异性杀伤;且用自身肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL对自身肿瘤细胞杀伤活性最大.结论: 以人肺癌总RNA体外转染DCs诱导CTL可以产生特异性抗肿瘤免疫,此方法构建肺癌疫苗是可行的.     

造血干细胞诱导树突状细胞的临床应用

目的:探讨回输自动员人外周造血干细胞(PBSC)体外诱导树突状细胞(DCs)治疗乳腺癌患者的可行性.方法:采用CS-3000血细胞分离系统分离9例粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预动员乳腺癌患者PBSC,在体外经rhGM-CSF、rhIL-4诱导和自体肿瘤细胞提取物刺激后成为成熟DCs,收集并自体回输.用MTT法测定DCs在体内外激活细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性.结果:9例患者平均采集1.02×109PBSC,培养后平均收获2.3×108DCs,CD83表达率平均为68.7%.收获DCs的数量是等量未动员全血的57.5倍.在体外自体肿瘤抗原致敏的DCs激活CTL对自体原代培养的肿瘤细胞具有显著的杀伤活性.DC瘤苗自体回输除轻微发烧外,无任何其它不良反应,回输后患者PBMC对自体肿瘤细胞的杀伤活性提高20倍.结论:用血细胞分离机分离G-CSF动员肿瘤患者PBSC,在体外诱导制备自体DC瘤苗,回输治疗可提高对自体肿瘤细胞的杀伤活性,而且安全可靠,无明显不良反应.     

CD14+单核细胞系白血病细胞来源树突细胞体外刺激特异抗白血病T细胞应答

背景与目的:白血病细胞能在体外分化为树突细胞(dendriticcells,DCs),从而有希望用于白血病的免疫治疗。本研究旨在探讨CD14高表达的单核细胞系白血病(M4、M5)细胞分化而来的DCs体外诱导抗白血病T细胞应答的能力。方法:取5例初诊CD14高表达的M4或M5型白血病患者的骨髓标本,分离单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells,BMMNCs),将白血病细胞分为3组:贴壁白血病细胞组、非贴壁白血病细胞组及总白血病细胞组。流式细胞术(flowcytometry,FCM)比较3组细胞的CD14表达。用含GM-CSF、IL-4和TNF-α或不含细胞因子的培养液培养细胞7～10天后,通过细胞形态学观察及FCM检测细胞表型,鉴定单核白血病细胞来源的DCs(monocyticleukemiacell-deriveddendriticcells,Mo-LDCs);采用异基因混合淋巴细胞反应(allogeneicmixedlymphocytereaction,Allo-MLR)以及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)抗白血病细胞毒分析检测Mo-LDCs的免疫功能,染色体核型分析结合异常表面抗原确定Mo-LDCs的白血病来源。结果:3组中贴壁白血病细胞的CD14含量最高,在细胞因子联合诱导下,可分化为大量CD83 成熟DCs。在同一病例的3组细胞以及不同病例的总单核细胞组间,培养前CD14的表达率与诱导后CD83 DCs的产率成正相关(r=0.967,P=0.007)。Mo-LDCs具有典型的成熟DCs的形态及表型特征,在Allo-MLR中能刺激同种T细胞明显增殖,并能刺激扩增特异性抗白血病CTL。同时,Mo-LDCs持续存在所起源白血病的核型异常和异常表达的髓系抗原。结论:在细胞因子组合诱导下,M4、M5亚型AML的CD14 细胞可分化为具有免疫功能的Mo-LDCs,单核系白血病细胞的CD14表达高低可能预示其DCs分化能力。Mo-LDCs具有经典的DCs的表型及功能,还具有白血病的克隆异常,可用于M4、M5患者的免疫治疗。     

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株的特异性杀伤作用

目的:探讨肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1(New York-esophageal-1)致敏树突状细胞体外诱导特异性CTL对肝癌细胞株的杀伤作用.方法:重组质粒pGEX-ESO1经原核诱导表达并纯化GST-ESO1融合蛋白肽.重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养人外周血来源的树突状细胞(dendritic cells, DCs),经GST-ESO1融合蛋白肽致敏后诱导特异性CTL增殖.以此CTL为效应细胞,分别以NY-ESO-1阳性表达的肝癌细胞株HepG2和不表达NY-ESO-1的肝癌细胞株H2P为靶细胞,MTT法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用.结果:重组质粒pGEX-ESO1经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达相对分子质量约36 000的GST-ESO1融合蛋白肽,纯化后的质量浓度为50 μg/ml;经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导成功培养人外周血DCs,其表型分子HLA-DR为91.4%、CD86为70.5%、CD83为71.2%、CD80为55.3%.NY-ESO-1致敏的DCs能明显诱导CTL增殖,此CTL对肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著高于GST刺激组、未致敏DC组和无DC刺激组(均P<0.05),效靶比为50 ∶1时杀伤效应达到最高峰[(53.23±3.78)%,P<0.01];相同条件下CTL对H2P细胞无特异性杀伤作用.结论: NY-ESO-1抗原致敏的DCs在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对NY-ESO-1阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗提供了一条新思路.     

从恶性胸腔积液体外诱导成熟树突细胞

背景与目的:树突细胞(dendriticcells,DCs)具有激活初始T细胞、引发抗原特异性免疫反应的特性。本研究拟用体外培养的方法,从肺癌患者恶性胸腔积液中诱导出功能健全的DCs。方法:取16例肺癌患者胸腔积液500～1000ml,用密度梯度离心辅以免疫磁珠分选的方法,分离出DCs前体细胞,加入IL鄄4、GM鄄CSF、TNF鄄α诱导出DCs。用电镜和光镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs的表面分子。将不同培养时间的DCs和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumorinfiltrativelymphocytes,TILs)作混合淋巴细胞反应,了解DCs对TILs的激活作用。结果:在体外能诱导出恶性胸腔积液来源的功能健全的DCs,电镜和光镜分析表明,这类DCs具有成熟DCs的典型形态;当DCs体外培养到第48h时,表面分子的表达率与培养0h、24h、92h、192h的DCs比较相对较高;DCs可使TILs细胞扩增。结论:可从肺癌患者恶性胸腔积液中诱导具有成熟功能的DCs。     

肺癌肿瘤全溶物脉冲自体树突状细胞体外诱生T细胞抗肿瘤反应的研究

目的　探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)患者全瘤溶解物 (WTL)冲击的自体树突状细胞 (DCs)瘤苗体外诱生T细胞介导的抗肿瘤反应。方法　在含重组人粒细胞 巨噬细胞 集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 )的培养条件下 ,以 10例患者的贴壁外周血单核细胞 (PBMCs)衍生不成熟的树突状细胞 (imDCs) ,分别添加肿瘤坏死因子 (TNFα)、自体WTL或WTL TNFα诱导成熟 ,即分别为DCs/TNF、DCs/WTL和 DCs/WTL ,用流式细胞仪和混合淋巴细胞反应 (MLR) ,检测细胞表面分子的表达变化及其刺激异基因或同基因的T细胞增殖能力。将 DCs/WTL和自体T细胞共培养1～ 2周 ,以诱导细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ,用计数γ 干扰素 (IFN γ)释放的酶联免疫斑点 (ELISPOT)试验和乳酸脱氢酶 (LDH)释放的细胞毒试验 ,分别检测该CTL中识别自体肿瘤细胞释放特异性IFN γ的T细胞数和溶瘤活性。结果　以 30 μg/ml蛋白的WTL体外冲击自体 10 6imDCs,可导致上调DC表型 ,包括CD1a、CD83和CD86以及HLA DR的分子表达 ,与常规TNFα诱导成熟的DCs表型相似。虽然两者均能显著刺激异基因T细胞的增殖 ,但其刺激自体T淋巴细胞的增殖能力 ,DCs/WTL却显著高于DCs/TNF(P <0 .0 5 )。将体外与 DCs/WTL共培养的自体T细胞作为反应或效应细胞 ,再次