抗人肺腺癌单抗5F-11噬菌体抗体库的构建及表达

目的　构建抗人肺癌单抗 5F 11的噬菌体显示文库。方法　利用RT PCR方法从 5F 11杂交瘤细胞扩增抗体轻重链可变区基因 ,用连接子连接成为ScFv基因后克隆至噬菌体载体pCANTAB5E。以肺腺癌细胞系A2 为抗原进行 4轮筛选 ,得到富集的次级噬菌体表达文库。结果　制备了库容为 8× 10 7pfu/ml的噬菌体展示文库。随机抽取未经筛选的克隆进行酶切 ,酶切图谱呈多样性 ,富集后的酶切图谱则显示特异构型的噬菌体得到富集。检测 30个噬菌体克隆上清 ,其中 2 3个与A2 细胞有较强反应。结论　本研究获得了抗人肺腺癌单抗 5F 11的单链抗体 ,为拓展抗体的应用创造了条件。     

人源噬菌体抗体对Peroxiredoxin I高表达肺腺癌细胞增殖的抑制作用

背景与目的：研究表明过氧化物酶Peroxiredoxin I （Prx I）与癌症的发展有密切关系。我们已通过噬菌体展示技术构建了肺腺癌相关的人源单链抗体库。本研究对该库进行筛选,得到抗PrxI肺腺癌单链抗体,并检测其对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法：PCR法检测TG1中scFv基因插入率,1％琼脂糖凝胶电泳鉴定蹄I和Not I双酶切质粒的结果,以A549细胞及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原分别对抗体库进行3轮筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。放射性核素计数法测定细胞单链抗体内摄水平,MTT法及流式细胞术检测单链抗体对A549细胞的增殖抑制和凋亡情况,免疫印迹法检测抗体作用A549细胞后PrxI的表达水平。结果：scFv基因插入率为77％,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中．肺腺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。ELISA法检测到在随机选取的10个克隆中．有6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率60％。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗Prx I肺腺癌单链抗体。被A549细胞内摄的单链抗体介导了细胞的凋亡以及细胞内PrxI蛋白表达水平的下降。结论：从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗PrxI肺腺癌单链抗体。单链抗体与肺腺癌细胞有特异性亲和力,并能有效抑制其增殖。     

人源噬菌体抗体对Peroxiredoxin Ⅰ高表达肺腺癌细胞增殖的抑制作用

背景与目的:研究表明过氧化物酶Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)与癌症的发展有密切关系。我们已通过噬菌体展示技术构建了肺腺癌相关的人源单链抗体库。本研究对该库进行筛选,得到抗Prx Ⅰ肺腺癌单链抗体,并检测其对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法:PCR法检测TG1中scFv基因插入率,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi Ⅰ和Not Ⅰ双酶切质粒的结果,以A549细胞及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白Prx Ⅰ为靶抗原分别对抗体库进行3轮筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。放射性核素计数法测定细胞单链抗体内摄水平,MTT法及流式细胞术检测单链抗体对A549细胞的增殖抑制和凋亡情况,免疫印迹法检测抗体作用A549细胞后Prx Ⅰ的表达水平。结果:scFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺腺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。ELISA法检测到在随机选取的10个克隆中,有6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率60%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗PrxI肺腺癌单链抗体。被A549细胞内摄的单链抗体介导了细胞的凋亡以及细胞内Prx...     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的：MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段（ScFv)。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重,轻链可变区DNA（VH和VL DNA）,两者经linker DNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5 ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果：VH,VL和ScFvDNA分别约为340bp,320bp和750bp,在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个,结论：用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的：对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定，筛选肝癌抗体，同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法：PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定；通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果：ScFv基因插入率为70％。在亲和筛选过程中，肝癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定，均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC-7721呈阳性反应，阳性率为90％，15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明，以正常胎肝细胞L-02为对照，ScFv与肝癌结合比率为41．3％。特异性鉴定表明，其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论：利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因，且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

特异性抗肝癌噬菌体单链抗体的应用研究

目的体外观察特异性抗肝癌(HCC)噬菌体单链抗体(ScFv)对HCC细胞生长和凋亡的影响.方法通过构建的特异性抗HCC噬菌体ScFv库在大肠杆菌HB2151中表达,制备游离ScFv,应用细胞培养、DNA凝胶电泳和流式细胞仪(FCM)技术检测抗体对HCC细胞生长和凋亡的影响.结果特异性抗HCC噬菌体ScFv处理的HCC细胞的生长速度明显减慢,克隆形成和附壁能力减弱,细胞存活率降低,DNA凝胶电泳可见典型凋亡梯状带;FCM检测发现抗体处理后HCC细胞凋亡率达32.6%,明显高于对照组(P＜0.01).结论应用噬菌体表面呈现技术和基因克隆技术构建的特异性抗HCC噬菌体ScFv具有抑制HCC细胞生长、促进HCC细胞凋亡的功能.     

EGFRvⅢ特异性单链抗体的制备及其靶向性能

目的:应用噬菌体展示技术筛选出能与EGFRvⅢ特异性结合的单链抗体(single-chain Fv,scFv),并研究其靶向性能。方法:构建EGFRvⅢ特异性scFv噬菌体库,ELISA筛选阳性克隆,阳性EGFRvⅢ-scFv质粒重新克隆入pCANTAB-Throm-bin-His载体,转化E.coli HB2151,IPTG诱导可溶性EGFRvⅢ-scFv表达。间接免疫荧光及裸鼠活体成像技术鉴定EGFRvⅢ-scFv与EGFRvⅢ的特异性结合。结果:成功构建了EGFRvⅢ-scFv噬菌体库,ELISA筛选得到16个EGFRvⅢ-scFv克隆,取一克隆命名为EGFRvⅢ-scFv-2A1。EGFRvⅢ-scFv-2A1质粒重新克隆入pCANTAB-Thrombin-His载体,成功表达可溶性EGFRvⅢ-scFv-2A1。EGFRvⅢ-scFv-2A1在体外可特异性结合HuH7-EGFRvⅢ肝癌细胞,但不结合HuH7-EGFR和HuH7肝癌细胞;荧光标记的EGFRvⅢ-scFv-2A1裸鼠体内可特异性结合U87MG-EGFRvⅢ胶质瘤细胞移植瘤,而不结合U87MG细胞移植瘤。结论:成功制备的EGFRvⅢ-scFv-2A1可特异性靶向结合EGFRvⅢ,在肿瘤的诊断和靶向治疗中具有潜在应用价值。     

抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选

目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

胰头癌手术切除可能性的术前评价

目的通过总结胰头癌病人的临床表现和影象学检查结果来评价手术切除的可能性。方法总结32例胰头癌病人的临床表现和CT、磁共振（MRI）检查结果,判断肿瘤是否已发生邻近浸润或远处转移,以此来评价其手术切除的可能性。结果在22例作CT检查的病例中,判断正确的为17例,准确率为77．3%。作MR检查9例,全部判断正确,准确率为100%。结论某些特殊的临床表现和CT、MR检查对判断肿瘤是否发生邻近浸润或转移有较大价值,为术前评价手术切除的可能性提供依据。