荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

10例感染A型流感病毒者随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测,试验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果试验组的确诊率和治疗效果均高于对照组,检测时间对照组为4～7d,而试验组可在4h内完成,治疗时间试验组也较短。差异均有统计学意义(P<0.05)。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒临床探析

目的:探析荧光定量RT-PCR检测方法对A型流感病毒检测的快速性、敏感性和特异性以指导临床治疗。方法:选择我院2011年9月至2012年3月收治的10例感染A型流感病毒病人,随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测,实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果:实验组的确诊率和治疗效果均高于对照组,且所用的检测时间和治疗时间均短,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:荧光定量RT-PCR检测A型流感病毒准确率高,对临床治疗有积极的指导作用。     

一步法实时荧光RT-PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用

目的建立一种能快速检测甲型流感病毒的一步法实时荧光PCR方法,对样本进行准确检测。方法以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,建立一步法实时荧光RT-PCR方法,并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒1、2、3型以及季节性流感病毒H1、H3进行检测,验证该方法的特异性和灵敏度,并对临床样本进行检测应用。结果所建立的一步法实时荧光RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增,操作方便快速,对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01TCID50/ml;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%。结论本研究建立的一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测,有助于对临床流感病例的快速诊断。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测甲型和甲型H1N1流感病毒

目的建立双重荧光RT-PCR快速检测方法,用于甲型和甲型H1N1流感病毒的同时检测和鉴别诊断。方法针对甲型流感病毒M基因和甲型H1N1流感病毒NA基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感或甲型H1N1流感含漱液标本检测。结果该方法对甲型、甲型H1N1流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.01 TCID50和0.1 TCID50,具有较好的稳定性。可从疑似流感或甲型H1N1流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。结论本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确检测甲型和甲型H1N1流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法。     

五重荧光定量RT-PCR法检测甲型流感病毒

目的建立一种五重荧光定量RT-PCR检测并鉴别流感病毒A(Flu A)及血凝素H3、H5、H7基因亚型的方法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RNase P)基因为内参照,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针。构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,利用不同来源的呼吸道病毒样本进行特异性分析。结果该法检测Flu A、H3、H5、H7以及RNase P质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L,特异性达100%,各对引物和探针仅检测出相应的病毒,未有交叉反应,变异系数(CV)≤1.99%。结论建立的五重荧光定量RT-PCR法灵敏度、特异性高,重复性好,可用于检测出多种甲型流感亚型,对甲型流感病毒不同亚型早期诊断具有一定的价值。     

3种流感病毒检测方法的比较和应用

目的探讨比较荧光定量RT-PCR、普通RT-PCR和细胞培养3种方法在流感病毒检测中的应用,从而确定每种方法各自的实用领域。方法通过荧光定量RT-PCR、普通RT-PCR和狗肾传代细胞(MDCK)培养3种方法检测398件流感样病例(ILI)咽拭子样本。比较3种方法的灵敏度和特异性。结果实时荧光RT-PCR检测阳性样本129件(阳性率为32.4%);普通RT-PCR检测出阳性样本93件(阳性率为23.4%);MDCK细胞培养法分离出流感病毒64株(阳性率为16.1%)。荧光定量RT-PCR的灵敏度达到0.01TCID50,特异性强。结论无论从敏感性、特异性还是从时间上,荧光RT-PCR对于疫情的爆发更有应用价值。细胞培养法分离流感病毒对于核实疫情的实验室诊断和病原学监测具有重大意义。     

促凝剂对乙型肝炎病毒实时荧光定量检测影响的评估

目的评估促凝剂对乙型肝炎病毒实时荧光定量检测的影响。方法随机采集2011年10月至2012年3月到西安市中心医院门诊的41例患者每人2管血样,分别为无添加剂普通管和促凝剂管,检测分离血清时间及效果。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA,结果对数值采用SPSS11.5统计软件进行处理,并对促凝剂管标本进行精密度和抗干扰性能评价。结果促凝剂管分离血清平均时间为(4.73±0.86)min,普通管为(14.46±2.27)min,两组数据经配对t检验,差异有统计学意义(P<0.01);促凝剂管乙型肝炎病毒DNA结果对数平均值为(3.86±2.99),普通管组对数平均值为(3.85±2.96),两组经配对t检验,差异无统计学意义(P>0.05),促凝剂管具有高精密度和抗干扰性能。结论促凝剂对乙型肝炎病毒实时荧光定量检测结果准确性没有影响,可减少报告周转时间,值得临床推广和应用。     

实时荧光定量RT-PCR技术检测siRNA对HBV复制的干扰效果

目的 运用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测小RNA分子（small interfering RNAs,siRNA）对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）复制的抑制作用.方法 在HepG2.2.15细胞内导入筛选的三条特异抗HBV的siRNA分子,用实时荧光定量RT-PCR的方法,检测干扰后HBV的mRNA表达水平.结果 导入特异siRNA分子的细胞中HBV的mRNA表达量明显降低.结论 实时荧光定量RT-PCR技术能准确可靠的检测mRNA的表达水平,对siRNA分子干扰效果的评价有很好的应用价值.     

五重荧光定量RT-PCR法检测呼吸道病毒

目的 建立一种五重荧光定量RT-PCR检测并鉴别流感病毒A( Flu A)、流感病毒B( Flu B)、呼吸道合胞病毒(RSV)以及新甲型H1N1流感病毒(nH1N1)的方法.方法 以人细胞RNA酶P基因为内参,用Primer Express 3.0设计PCR引物和探针.用一系列不同滴度的病毒培养物和不同来源的呼吸道...     

Development and comparative evaluation of real-time PCR and real-time RPA assays for detection of tilapia lake virus

Tilapia lake virus (TiLV) is a newly emerged pathogen responsible for high mortality and economic losses in the global tilapia industry. Early and accurate diagnosis is an important priority for TiLV disease control. In order to evaluate the methodology in the molecular diagnosis of TiLV, we compared newly developed quantitative real-time PCR (qPCR) and real-time recombinase polymerase amplification (real-time RPA) assays regarding their sensitivities, specificities and detection effect on clinical samples. Real-time RPA amplified the target pathogen in less than 30 min at 39 °C with a detection limit of 620 copies, while qPCR required about 60 min with a detection limit of 62 copies. Both assays were specific for TiLV and there were no cross-reactions observed with other common fish pathogens. The assays were validated using 35 tissue samples from clinically infected and 60 from artificially infected animals. The sensitivities for the real-time RPA and qPCR assays were 93.33 and 100%, respectively, and the specificity was 100% for both. Both methods have their advantages and can play their roles in different situations. The qPCR is more suitable for quantitative analysis and accurate detection of TiLV in a diagnostic laboratory, whereas real-time RPA is more suitable for the diagnosis of clinical diseases and preliminary screening for TiLV infection in poorly equipped laboratories as well as in fish farms.     

Detection of seasonal H3N2 influenza A virus by type-specific TaqMan minor groove binder probe assay

Despite the emergence of the pandemic H1N1 influenza A virus in 2009, seasonal H3N2 viruses continue to co-circulate in the population and may even predominate in the coming influenza season. We describe a specific minor groove binder TaqMan assay for H3N2 viruses with a detection limit of 16.5 standard DNA copies.     

B型流感病毒相关研究进展

B型流感病毒为季节性流感病毒的一种,每年在人群中呈不同程度的流行。B型流感病毒与A型流感病毒在基因结构和编码蛋白等方面存在差异,主要引起局部暴发和流行,并倾向于感染特定人群,因此除典型的感染症状外还易引起并发症。在一些流行季节,B型流感病毒造成的疾病负担甚至超过A型流感病毒。应加强B型流感病毒的监测和相关研究工作,为B型流感疫苗的推荐和新型药物的研发提供更多的科学依据。     

双探针实时荧光定量PCR检测对拉米呋啶耐药的乙型肝炎患者HBV变异

目的研究双探针实时荧光定量PCR方法检测对拉米夫定耐药的乙肝患者血清中HBV病毒变异的可行性。方法用双探针MGB实时荧光定量PCR法检测拉米夫定治疗后的乙型肝炎患者血清,确定HBV YMDD变异类型,与测序法进行比对。结果68例标本中本法测出27例YMDD野生株,20例Y IDD变异株,11例YVDD变异株,与直接测序结果一致。另有10例标本测得为混合株,经克隆后测序证实,混合株中存在优势株。直接测序只能检测出优势株。结论双探针MGB实时荧光定量PCR法可以快速、准确地测出HBV DNA混合变异毒株。     

2013-2015年天津市流感暴发疫情流行特征分析

目的 对天津市2013-2015年流感暴发疫情的分布特点进行分析,同时探讨疫情报告及时性对疫情流行强度的影响。方法 收集2013-2015年天津市流感暴发疫情资料,分析其分布特点,并应用相关分析研究疫情报告及时性和疫情流行强度的关系。结果 2013-2015年天津市共发生31起流感暴发疫情,平均罹患率为3.54%。全部发生在学校。77.41%的疫情发生在小学。暴发病原类型主要是H3N2型、甲型H1N1型和乙型流感病毒。首次报告病例数,首发病例发病到报告的时间间隔与暴发疫情罹患率和持续时间均呈正相关（P0.05）。结论 天津市流感暴发主要场所为学校,提高疫情报告及时性,及早采取控制措施是减少学校流感暴发疫情流行强度的关键。     

Comparison of BinaxNOW Influenza A&B assay and real-time reverse transcription polymerase chain reaction for diagnosis of influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus infection in adult patients

The BinaxNOW Influenza A&;B assay was evaluated for the diagnosis of influenza A pandemic (H1N1) 2009 virus infection in 354 adult patients. The sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values were 32%, 100%, 100%, and 67%, respectively. The analytic sensitivity of the assay was log₁₀ 5.0 tissue culture infective dose (TCID)₅₀/mL.     

RT—LAMP法快速检测人季节性流感病毒

目的 建立并应用RT-LAMP法检测人季节性流感病毒.方法 选择并合成针对甲1型、甲3型、乙型流感病毒基因的保守区引物,并对南京地区2007年11月～2009年2月400份临床流感样患者的咽拭子标本进行检测.这些样本同时用MDCK细胞进行流感病毒的分离,用特异性单抗血凝抑制试验进行亚型鉴定.结果 用该法从57份临床流感样患者的咽拭子标本中检测出流感病毒,其中49份为甲1型,6份为甲3型,2份为乙型.用MDCK细胞分离鉴定出55份阳性,其中47份为甲1型,6份为甲3型,2份为乙型.两种方法的检测结果无统计学差异（P〉0.05）.RT-LAMP法为等温扩增,可用水浴锅代替PCR仪,检测结果在可见光下或紫外灯下直接肉眼观察.结论 RT-LAMP法对人季节性流感病毒的检测有高度的特异性,对禽流感病毒H5、H9无交叉反应,可用于季节性流感病毒的亚型鉴定.     

登革病毒TaqManMGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床。方法根据1～4型登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列,设计一套型通用的引物和TaqManMGB探针,以4个血清型登革病毒标准株为标准,以日本乙脑病毒和丙肝病毒作阴性对照,以包含登革病毒2型标准株（DENV-2NGC株）3’非编码区349bD片段的质粒DNA作标准品,对引物和TaqManMGB探针的特异性、灵敏度进行分析,从而建立登革病毒实时荧光定量PCR检测方法。用该法对登革病毒野毒株和10份登革病毒患者血清进行检测。结果TaqMan实时荧光定量PCR检测的1～4型登革病毒标准株及野毒株均为阳性,日本乙脑病毒和丙肝病毒均为阴性;检测灵敏度可达到每反应2个基因拷贝;检测的10份登革患者血清样本中,8份检测结果为阳性。结论TaqManMGB实时荧光定量PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革病毒的临床早期诊断。     

Development and preliminary testing of a probe-based duplex real-time PCR assay for the detection of African swine fever virus

An outbreak of African swine fever (ASF) in China in 2018 caused substantial economic losses to the swine industry. To accurately diagnose clinical infection with ASF virus (ASFV), we developed a TaqMan probe-based duplex real-time PCR that simultaneously detected two discontinuous genes in the virus genome, thereby preventing the inaccurate results obtained with only one reaction. Two sets of ASFV gene-specific primers, along with two fluorescent TaqMan probes were designed to target conserved regions of the B646L and B438L genes. This method had high sensitivity and specificity, with a limit of detection of 10 copies/μL, and it did not cross-react with the genomes of other viral pathogens that affect pigs (i.e., CSFV, PRRSV, PEDV, PRV, PPV and PCV2). Overall, 180 clinical samples from ASFV-infected pig farms were used to compare this method with a commercial kit, which yielded excellent consistency (98.3%). This new diagnostic method should greatly improve the efficiency of ASFV surveillance and reduce economic losses, providing benefits for both animal and public health.     

双重荧光定量PCR检测西尼罗病毒和基孔肯雅病毒

摘要：目的：建立同时检测西尼罗病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）的双重荧光定量PCR法,为临床疑似病例的诊断提供依据。 方法：分别针对WNV CAP基因、CHIKV E1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重荧光定量PCR反应体系,评价方法的特异性和灵敏度。 结果：建立的双重荧光定量PCR可同时检测WNV、CHIKV核酸,标准曲线相关系数（r）分别达0.999、0.998,灵敏度达10 copies/μL,具有良好的特异性。 结论：建立了同时检测WNV、CHIKV的双重荧光定量PCR法,但尚需临床进一步验证。