异种脱蛋白松质骨支架体内移植后血清T细胞亚群的变化

背景：研究提示异种脱蛋白松质骨可能成为一种极有实用价值的骨组织工程支架材料,但仍缺少细胞生物学及免疫学论证。 目的：脱蛋白法制备骨组织工程用的异种松质骨支架,探讨其山羊体内移植后免疫学性能。 方法：成年猪股骨远端松质骨,采用逐级脱蛋白方法去除异种骨中的抗原性成分。取6~8月龄雄性山羊8只随机分成2组,实验组双侧3、4横突间各植入脱蛋白松质骨2块。对照组植入相同数量未经处理新鲜松质骨。 结果与结论：采用脱蛋白处理后的猪松质骨光镜下可见骨孔内无细胞、神经、血管和嗜酸性物质染色。脱蛋白松质骨中胶原类氨基酸含量高,与新鲜松质骨相比无明显差异,而酪氨酸、色氨酸和半光氨酸波峰消失。新鲜松质骨氨基酸含量为19.89%,脱蛋白松质骨氨基酸含量为18.06%。脱蛋白松质骨植入后各时间点CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD28⁺水平与植入前相比基本保持一致,植入4周后局部抗原免疫组织化学未见阳性表达。提示经脱蛋白处理后异种松质骨低免疫原性,植入体内后没有特异性抗体产生,具有良好的组织相容性。     

异种脱蛋白松质骨支架在脊柱横突间融合中应用的可行性

背景：现如今关于组织工程骨的相关研究大多集中在骨干临界性骨缺损方面,关于其在脊柱融合中的相关研究和报道相对较少。 目的：探讨在脊柱横突间融合治疗中异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架的应用可行性。 方法：取成年猪股骨远端松质部分,制备异种脱蛋白松质骨材料,与重组人骨形态发生蛋白复合后,再复合骨髓间充质干细胞制备组织工程骨。取24只山羊,制备横突间植骨床,随机均分为2组,观察组左侧植入组织工程骨,右侧植入载重组人骨形态发生蛋白的异种脱蛋白松质骨;对照组左侧植入自体髂骨,右侧植入异种脱蛋白松质骨。植入后4,8,12周获取融合节段,进行大体观察、X射线观察、组织学观察及生物力学检测。 结果与结论：X 射线显示,两组植入材料均固定良好,固定效果可靠。植入后不同时间点,各组植入材料均处于良好位置,材料周围组织未出现化脓或者坏死等,且均出现软组织长入、包裹,植入材料周围均未出现积液和坏死等,其中组织工程骨组影像学表现与组织学表现优于载重组人骨形态发生蛋白异种脱蛋白松质骨组、异种脱蛋白松质骨组,与自体骨最接近。植入后12周,组织工程骨组最大弯曲载荷最接近自体髂骨组,两组间比较差异无显著性意义。表明在脊柱横突间融合治疗中,异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架具有一定的应用可行性。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

猪-人-鼠嵌合体动物模型的建立及介导人T细胞对猪异种抗原的耐受

目的： 通过共移植人胎胸腺、胎肝组织及猪骨髓细胞于SCID鼠体内,建立猪-人-鼠嵌合体模型,介导人T细胞对猪异种抗原的免疫耐受。方法:实验鼠分成3组：A组为猪骨髓细胞移植组,B组为人胎胸腺、肝脏组织移植组,C组为猪骨髓细胞＋人胎胸腺+肝脏组织移植组;在移植后每3周,用流式细胞仪测定猪和人嵌合体的水平,直至20周;通过混和淋巴细胞反应确定人T细胞的功能及对猪异种抗原的耐受情况。 结果:猪嵌合体在所有实验鼠（包括共移植人组织的实验鼠）中持续时间均超过20周;在移植人胎组织20周时,T细胞的数量为0.7×106/L,在外周血细胞中所占的百分比为0.14%±0.01%;人嵌合体在所有实验鼠（包括共移植猪骨髓细胞的实验鼠）中持续时间亦超过20周。结论: 通过共移植人胎胸腺、胎肝组织及猪造血干细胞于SCID鼠体内,可以建立猪-人-鼠嵌合体模型,并能诱导人T细胞对猪异种抗原的免疫耐受。     

改良法制备异种脱蛋白骨体内植入修复骨缺损的免疫学分析

背景:在支架材料选择中,目前尚未完全解决异种骨的免疫原性问题。目的:观察改良法制备异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料修复骨缺损后机体的免疫学改变。方法:SPF级青山羊18只,随机分为3组,正常骨组不截骨,自体骨组、异种脱蛋白骨组在羊右侧胫骨中下段造成胫骨总长度20%骨膜和骨缺损。自体骨组在缺损处植入羊自体骨;异种脱蛋白骨组培养收集羊自体骨髓间充质干细胞,调整细胞数为1×109L-1,将2mL细胞悬液接种于以猪股骨为原料改良制备的猪脱蛋白骨上,再加入重组人骨形成蛋白2,半环槽外固定。采用流式细胞仪进行CD4+及CD8+T淋巴细胞、血清抗体IgG免疫学检测,以双能X射线测量仪分析骨缺损修复效果。结果与结论:异种脱蛋白骨组植入后3,7,14,28d外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞的含量基本正常(P0.05),血清抗体IgG水平略高于自体骨组(P0.05);植入后24周骨密度、骨矿物含量与自体骨组基本相似(P0.05),表现为骨缺损区两断端之间高密度钙化影。3组抗压缩压强及极限压强、抗弯曲载荷及极限载荷、抗扭转转矩及极限转矩均基本相似(P0.05)。植入后24周与自体骨组比较,异种脱蛋白骨组的成骨能力无明显差异(P0.05)。提示改良法制备的异种脱蛋白骨不引起明显的细胞和体液免疫反应,有良好的组织相容性,不影响自体骨髓间充质干细胞成骨,新骨生物力学性能与自体骨相当。     

异种脱细胞真皮替代睑板材料重建眼睑的可行性

背景：眼睑后层重建是眼睑重建的重点和难点,其中睑板替代物更是研究的焦点。异种脱细胞真皮作为一种新型的组织工程材料,在国内外烧伤整形领域,正得到广泛的研究和应用。 目的：观察异种(猪)脱细胞真皮植入兔眼睑后的组织相容性极其组织病理学变化。 方法：剥取健康小白猪全层皮肤20 cm×20 cm,制备异种(猪)脱细胞真皮基质。同时制备兔睑板全层缺损模型并植入脱细胞真皮基质,观察大体情况,并分别于第1,2,3周取移植交界处眼睑组织光镜下观察组织学的改变。 结果与结论：大体观察未见明显排斥反应及眼睑的变形;光镜下1周时可见局部炎症细胞浸润,2周时炎症细胞减少,3周时正常纤维组织长入,逐渐分割代替植入的胶原纤维,炎症反应消失。提示异种脱细胞真皮免疫原性低,并可引导新生胶原的生长,是一种良好的睑板替代物。     

异种去抗原松质骨成骨效能的实验研究

 目的：研究异种去抗原松质骨与基因重组人骨形成蛋白2 (recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2)复合后的生物相容性和成骨效能。方法：28只新西兰大白兔28处颌骨缺损完全随机分为3组：异种去抗原松质骨/rhBMP-2组（A组）、异种去抗原松质骨组（B组）和空白对照组（C组）。A组和B组每组12处骨缺损,于4、8和12周分别进行大体观察、X线检查、HE染色和新生骨量测定;C组共4处骨缺损于12周时进行大体观察、X线检查和HE染色。结果：X线显示,随着时间的增长,2组的植入骨逐渐降解吸收,由自体骨替代,A组较B组显著;C组12周时无法完成愈合。骨密度测量显示,随着时间的增长,A和B组的骨密度值增加,2组之间存在显著差异（P<0.05）。HE染色可见A组的新生血管、纤维组织和新生骨均较B组多;植入骨降解速度快于B组;A组新生骨面积大于B组（P<0.05）。结论：异种去抗原松质骨是rhBMP-2的良好载体;异种去抗原松质骨/rhBMP-2复合材料能持续成骨,可加速骨缺损修复的速度,是一种较好的骨修复材料。     

异种肌腱移植免疫反应的处理方法

背景：异体肌腱移植是目前修复肌腱缺损的理想方法。其中异种肌腱供源丰富,但移植后的排斥反应为其使用受到限制的主要原因。 目的：对异种肌腱的抗原性和移植后的免疫反应及降低异种肌腱排斥反应的方法的研究进展进行综述。 方法：第一作者应用计算机检索PubMed数据库和CNKI数据库中1995-01/2010-12在标题和摘要中以“肌腱,异体移植,免疫”或“tendons,transplantation Immunity,”为检索词进行检索。选择文章内容与肌腱移植免疫反应相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到196篇文献,根据纳入标准选择30篇文章进行综述。 结果与结论：目前对异种移植物抗原的研究包括半乳糖-a-1,3-半乳糖抗原(Gal)和非Gal抗原,以对Gal抗原基因研究的较多。Gal抗原由存在于哺乳动物细胞表面的Gal-a-1,3-Gal抗原引起,是引起超级排斥反应的主要因素。异种肌腱移植后早期以细胞免疫为主,晚期仅有体液免疫参与;动物实验表明经不同物理和化学方法处理后的异种肌腱有潜在应用价值。肌腱移植不同于器官移植,肌腱移植属于非功能性移植,异体肌腱只为受区提供一个生长支架,移植后的生物学特点主要体现在生物力学上,因此,探讨出新的消除免疫原性同时保留移植物生物力学特性的方法是异种肌腱移植获得突破的关键。     

同种异体松质骨支架材料的制备及理化特性

背景：同种异体脱脂、脱蛋白松质骨具有与受体相同的三维立体结构,力学性能稳定,排异反应弱,细胞相容性好等独特的生物学性能。 目的：通过理化方法制备同种异体脱脂、脱蛋白松质骨支架材料,分析其理化特性。 方法：剥离兔髂骨10对,制作成约1.0 cm×0.8 cm×0.1 cm的骨条,经脱脂、脱蛋白、深低温冷冻处理制备骨支架材料,检测其生物化学性能。测定支架材料与骨髓间充质干细胞的黏附率;将支架植入同种属动物体内,观察其组织相容性、免疫反应。 结果与结论：同种异体脱脂、脱蛋白松质骨支架材料保留了天然骨组织的网状孔隙结构,孔隙率为(80.23±5.65)%,孔径最大为(318.11±17.51) μm,最小为(209.37±11.33) μm。骨髓间充质干细胞不仅能与支架黏附,而且能在支架上分裂、增殖。兔体内植入6周后支架周围界面未引起明显的炎症和排斥反应,并形成少量骨样组织。说明脱脂、脱蛋白松质骨支架具有适宜的三维多孔结构,与种子细胞黏附率高,有良好的生物相容性和细胞-材料界面作用;同时有一定的成骨作用。     

脱蛋白松质骨作为异种骨移植材料的修复作用

背景：采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,有良好的细胞相容性,可能是一种新型骨移植材料。 目的：介绍异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体的性能,以及其用于骨融合的作用。 方法：分别以“异种脱蛋白松质骨、骨融合、载体”,为检索词,应用计算机检索重庆维普(VIP)期刊全文数据库及Pubmed 数据库1998-01/2009-12有关文章,排除与研究目的无关和内容重复者,保留33篇文献做进一步分析。 结果与结论：动物骨均有相似的生物材料结构和造型,较人工合成材料骨具有极好的细胞贴附性和细胞生长增殖环境。但由于异种骨移植时种属间的抗原差异,存在剧烈的免疫排斥反应,骨组织兼容性差,关键问题是植入体内免疫问题。如能克服免疫原性,异种脱蛋白松质骨是一种良好的组织工程骨载体材料,可为再血管化和成骨细胞的分化提供一个稳定的环境。     

兔脂肪源性干细胞的成骨诱导及其与异种松质骨的生物相容性研究

探讨异种松质骨作为支架材料的前景,并观察其与成骨诱导前后脂肪源性干细胞的生物相容性。取兔脂肪源性干细胞,诱导成骨并检测。将诱导成骨和未诱导的脂肪源性干细胞接种至松质骨支架上。扫描电镜观察,并计算细胞24 h的贴壁率。将细胞-支架复合物及单纯支架分别植入家兔皮下,10天后处死取材,HE染色行组织学分析。结果表明:兔脂肪源性干细胞在体外诱导培养后,碱性磷酸酶含量升高,诱导2周后茜素红染色阳性,提示脂肪源性干细胞向成骨方向分化。扫描电镜观察显示:诱导成骨和未诱导的脂肪源性干细胞均能与异种松质骨支架材料复合良好,二者24 h的贴壁率差别无统计学意义。由此说明:脂肪源性干细胞能够在体外诱导成骨,且异种松质骨支架材料与其有良好的生物相容性,提示脂肪源性干细胞能够作为骨组织工程的种子细胞,同时也提示异种松质骨能够作为支架材料用于骨组织工程研究。     

脱蛋白联合冷冻干燥法制备异种骨的实验研究

目的通过脱蛋白联合冷冻干燥的方法制备异种骨,探讨其能否在保持其生物力学特性的同时良好地消除异种骨的抗原性,以满足骨移植的需求。
　　方法取牛股骨上端去除表面筋膜、结缔组织和皮质骨部分,制备成骨粒和圆柱形骨棒。将十二烷基苯磺酸钠（ABS）和脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（AES）以及蒸馏水以重量比13：7：80的比例配制复合表面活性剂。将牛骨粒或者骨棒与复合表面活性剂以重量比1：10的比例置于烧瓶中,超声振荡清洗,去除其抗原性,电镜下观察其结构。骨粒和骨棒经乙醇和乙醚脱水、脱脂,冷冻干燥。骨粒用作溶血试验和细胞毒性检测,骨棒进行新西兰大白兔的长期骨植入实验（4、12、26、52周）检测其生物相容性。乙醇抽吸法检测脱蛋白-冻干骨与未脱蛋白的单纯冻干骨的孔隙率。并且比较牛松质骨骨粒与脱蛋白-冻干松质骨骨粒的生物力学特性差异。
　　结果电镜下观察,制备的异种骨材料为天然多孔结构,保留了骨组织的三维结构,骨小梁间有200~650μm 骨髓腔。溶血率检测未超过5%,判定溶血率合格。细胞毒性检测为1级,极低细胞毒性,材料合格。长期骨植入实验表明,植入4周即有植入的骨棒与兔自身骨出现融合,未见严重炎症反应;52周时,植入骨已完全吸收。孔隙率检测表明,脱蛋白-冻干骨与未脱蛋白的单纯冻干骨相比无显著性差异,均可达到60%以上,符合骨移植材料的要求。脱蛋白-冻干骨以及未脱蛋白的单纯冻干骨的力学特性与新鲜松质骨块相比均有显著降低,但两者之间无显著性差异。结论通过脱蛋白联合冷冻干燥的方法制备的异种骨,能够在保持其生物力学特性的同时良好地消除抗原性;满足骨移植的需求。     

去抗原异种松质骨复合骨髓基质干细胞修复骨缺损

目的研制理想的能够修复骨缺损的骨材料,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法体外扩增诱导兔骨髓基质干细胞,将其与去抗原异种松质骨复合培养。造成兔桡骨中段10mm骨缺损模型,分复合细胞组、单纯材料组、空白对照组。通过大体观察、放射学检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果去抗原异种松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损,12周时缺损区完全被新骨代替,骨髓腔完全通畅,优于单纯材料组的修复效果,单纯材料组优于空白对照组。结论去抗原异种松质骨具有良好的成骨能力,有可能成为理想的骨支架材料。     

生物型人工韧带的制备及体外检测

目的探讨应用新的组织处理技术研制的生物型人工韧带应用在膝关节交叉韧带重建的可行性。方法以猪肌腱韧带为原料应用环氧化物作为交联剂加上专门的除抗原技术及蛋白修饰技术制作生物型人工韧带,在体外应用组织学检查、扫描电镜、细胞培养和力学测试分析生物型人工韧带的组织结构、生物力学和细胞的相容性。结果生物型人工韧带的外观与正常肌腱外观相似。组织学检查显示韧带为无细胞的胶原纤维。电镜检查显示韧带为走向一致的发状纤维样物紧密平行排列,表面有棉絮样物附着,未见细胞。人工韧带支架经生理盐水多次洗涤,洗去抗菌保存液后将异种骨髓基质细胞于支架中培养2周可见细胞成活。培养3周,韧带材料表面可见细胞粘附,内部未见细胞。扫描电镜观察,韧带材料中细胞培养3周,细胞呈球形粘附在韧带材料表面及孔隙侧壁,并可见细胞分泌的基质沉积于细胞周围,但基质分泌量较少。力学测试人工韧带直径约5mm,最大拉力为927.19N,抗拉强度47.22N/mm,速度100mm/min。正常山羊的前交叉韧带(ACL)直径约5mm,最大拉力为807.50N,抗拉强度41.13N/mm。结论应用新的组织处理技术研制的生物型人工韧带有效地去除了猪肌腱的异种蛋白的免疫原性,具有良好的生物力学特性,韧带材料的细胞相容性较好。有望应用在膝关节叉韧带重建,成为生物性人工韧带的理想产品。     

Application of xenogeneic stem cells for induction of transplantation tolerance: present state and future directions

Xenotransplantation using pig organs provides a possible solution to the severe shortage of allogeneic organ donors, one of the major limiting factors in clinical transplantation. However, because of the greater antigenic differences that exist between different species than within a species, the immune response to xenografts is much more vigorous than to allografts. Thus, tolerance induction is essential to the success of clinical xenotransplantation. Tolerance induced by mixed hematopoietic chimerism across the MHC barrier is remarkably robust, but its ability to induce tolerance across highly disparate xenogeneic barriers remains poorly studied. None of the current available regimens of host conditioning, which permit hematopoietic stem cell engraftment and chimerism induction in allogeneic or closely related (concordant) xenogeneic combinations, has been demonstrated to be effective in establishing porcine hematopoietic chimerism in a discordant xenogeneic species. Unlike bone marrow transplantation within the same species, the innate immune system and the species specificity of cytokines and adhesion molecules essential to hematopoiesis pose formidable obstacles to the establishment of donor hematopoiesis across discordant xenogeneic barriers. The genetic incompatibility between species may also impede xenograft tolerance induction by mixed chimerism. While we remain far from achieving tolerance in clinical xenotransplantation, recent studies using a transgenic mouse model have proven the principle that mixed hematopoietic chimerism may induce mouse and human T cell tolerance to porcine xenografts. This review article focuses on the barriers to porcine hematopoietic engraftment in highly disparate xenogeneic species and the possible application of mixed hematopoietic chimerism to xenograft tolerance induction.     

Chemical, structural properties, and osteoconductive effectiveness of bone block derived from porcine cancellous bone

The purpose of this study is to determine the efficacy of bioactive calcium phosphate obtained from porcine cancellous bone for the treatment of bone defects and nonunion. Porcine cancellous bone blocks were heat treated at 1300 degrees C for 2 h. The chemical composition, calcium-to-phosphate ratio, and microstructure of the porcine bone blocks were examined. For in vivo implantation, bone defects were created on the anteromedial aspect of the proximal tibia in seven beagle dogs and the xenograft bone blocks were placed into these defects. Plain radiographs were taken at 2-week intervals for roentgenographic evaluation. At 12 weeks, the specimens were stained with hematoxylin and eosin (H&E). The composition and morphology of heat-treated porcine cancellous bone were found to be similar to heat-treated human cancellous bone. Radiographs showed union between the host bone/bone-block interfaces. At 12 weeks, uniform and substantial new bone formation was observed. It is concluded that heat-treated porcine cancellous bone demonstrated effective osteoconductivity. This high-temperature heat-treatment technique has several advantages, including decreased risk of disease transmission and immunoreactivity, while also offering excellent biocompatibility.     

Increased new bone formation with a surface magnesium-incorporated deproteinized porcine bone substitute in rabbit calvarial defects

This study investigated the effects of magnesium ion (Mg) incorporation into the surface of deproteinized porcine cancellous bone in the bone healing of rabbit calvarial defects with the expectation of utilizing the integrin-ligand binding enhancement effect of Mg, and compared its bone healing capacity with that of untreated porcine cancellous bone and deproteinized bovine bone (Bio-Oss). Hydrothermal treatment was performed to produce Mg-incorporated porcine bone using an alkaline Mg-containing solution. The surface morphology and chemical composition of the samples were investigated using scanning electron microscopy, energy-dispersive X-ray spectrometry, and X-ray photoelectron spectroscopy. Defects 7 mm in diameter were created in the calvaria of 14 adult male New Zealand White rabbits and were filled with (1) untreated porcine bone (PB), (2) Bio-Oss, and (3) Mg-containing porcine bone (MG). The percentage of newly formed bone (NB%) was evaluated histomorphometrically at 2 and 4 weeks after implantation. Hydrothermal treatment resulted in a Mg-containing surface in porcine bone covered with nanostructures ~100 nm in size. The MG group supported better new bone formation compared with the other groups. Osteoconductive new bone formation was observed in the central defect area in the MG group at an early healing time-point. Histomorphometric analysis revealed significantly greater NB% in the MG group when compared with the untreated PB and Bio-Oss groups at 4 weeks (p < 0.05). The Mg-incorporated porcine bone with surface nanostructures achieved rapid new bone formation in the osseous defects of rabbit calvaria compared with untreated xenografts of porcine and bovine origin.     

同种异体BMSCs、ADSCs移植后的抗原性差异

目的　探讨骨髓来源间充质干细胞（MSCs from bone marrow, BMSCs）与脂肪来源间充质干细胞(Adipose tissue-derived MSCs,ADSCs)体内移植后的抗原性差异。 方法 体外培养WKY大鼠BMSCs、ADSCs,经成骨诱导后植入wistar大鼠桡骨缺损区,分别于植入后1、2、4、8周进行缺损区HE染色,于1、2、4、8周免疫组化检测缺损区IL-2、TGF-β、TNF-α、CD4、CD8,采用ELISA法检测脾细胞培养液上清IL-2、TGF-β、TNF-α的含量。 结果 BMSCs、ADSCs移植术后1～2周有少量淋巴细胞、白细胞浸润,IL-2、TGF-β、TNF-α、CD4、CD8蛋白少量表达;二者比较差异无显著性。 结论 BMSCs、ADSCs体内移植后所致的抗原性无显著性差异。