人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和诱导分化能力的研究

目的 从脐血中分离单个核细胞(MNCs)，体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能。方法 取35份足月顺产新生儿脐血，密度梯度离心法分离出其中的MNCs，采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs。显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色，流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型，体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力。结果 从12份脐血中可培养出MSCs，形态上与从其他来源的MSCs类似，可传至20代而无形态上的变化。细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性，非特异性酯酶——α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyrjc acid esterase，NBE)阳性。其表达CD29、CD44和CD105，特别是人类MSCs标记SH-2和SH-3阳性，而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性，说明它们并非来自造血细胞。这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下，2周左右可以诱导分化形成骨细胞，20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞。脐血MSCs预诱导12h后，胞体发生收缩，细胞边缘有细的突起。正式诱导5h后大多数细胞呈现典型的神经元样。结论 胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs。这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能。     

人脐血及脐带间充质干细胞的分离培养及表面标记分析

目的探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记。方法人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton’s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代。将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况。利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原。结果经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一。人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代。经冷冻保存,复苏后仍能较好生长。人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达。结论人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源。     

Isolation,culture and detection of molecular marker of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood and umbilical cord

目的 探讨从人脐带血及脐带分离和培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并分析MSCs的表面标记.方法 人脐带血按常规方法制备单个核细胞,利用MSCs贴壁生长的特性,经培养、换液、传代纯化MSCs;分离脐带华尔通胶(Wharton＇s jelly),采用组织块贴壁法获得脐带MSCs并传代.将传代的MSCs冻存,1个月后再复苏,观察复苏后MSCs的生长情况.利用FACScan流式细胞仪检测脐带血及脐带细胞表面抗原.结果 经过传代后,贴壁细胞形态趋于同一.人脐血及脐带MSCs体外生长形态相似,类似成纤维细胞,可以稳定增殖和传代.经冷冻保存,复苏后仍能较好生长.人脐血及脐带来源的MSCs表面标记CD29、CD44、CD59高表达,而表面标记CD14、CD33、CD34和CD45低表达.结论 人脐带血及脐带均可分离出MSCs,在体外能扩增纯化及冻存复苏,为组织工程提供丰富的细胞来源.     

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化可能性,为心肌细胞移植探索新细胞来源。方法采用5-氮杂胞苷（5-Aza）和二甲基亚砜（DMSO）诱导人脐带间充质干细胞分化。观察诱导后分化细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化心肌样细胞的心肌肌钙蛋白I（troponin I）、心肌肌钙蛋白T（troponin T）和心肌结蛋白（desmin）,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定分化的心肌样细胞是否有细胞心肌特异转录因子（Nkx2.5）和心肌细胞desmin的cDNA表达。结果人脐带MSCs经5-Aza和DMSO诱导后可向心肌样细胞分化,分化细胞表达心肌细胞的标记troponinI、troponinT和desmin。RT-PCR检测证实,人脐带MSCs诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经5-Aza和DMSO诱导后表达心肌细胞标记Nkx2.5和desmin。结论人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,5-Aza和DMSO可作为心肌细胞诱导剂,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞的来源。     

脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下的生殖细胞特性

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能.方法 采用组织块贴壁法获得MSCs,取第3代MSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养.用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察2组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法 检测2组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f;Western blot进一步检测2组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况.结果 以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,对照组细胞形态不发生类似变化,超微结构也显示了很大的差异;免疫组织化学证实实验组细胞表达精原细胞的标记物CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Westem blot进一步证实人脐带MSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f.结论 用组织块贴壁法获得人脐带来源的MSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的MSCs具有向精原细胞方向分化的潜能.     

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。     

丹参联合骨髓间充质干细胞移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)植入缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑后,植入MSCs在脑组织中的迁移、神经细胞抗原分化率的变化,探讨丹参联合MSCs移植治疗新生儿HIE的可行性.方法 将36只7日龄新生SD大鼠随机分为正常对照组(8只)、HIE组(8只)、MSCs移植组(10只)、MSCs移植+丹参组(10只).在MSCs移植后18 d取脑组织后做石蜡切片,免疫组织化学法检测并计数进入脑组织的MSCs,观察植入细胞在脑组织中的分布、迁移;免疫荧光双标记法检测植入细胞神经元巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察其向神经细胞的分化,并进行组间比较.结果 植入MSCs主要分布于HIBD组左侧大脑皮质区,MSCs移植+丹参组标本中MSCs更多向右侧大脑半球迁移,且分布范围更广,与MSCs移植组比较,不同脑组织层面、两侧大脑半球MSCs计数均有统计学差异(Pa＜0.05);免疫荧光双标记法观察MSCs主要在左侧大脑皮质、海马等部位分化为神经细胞,Nestin、NSE、GFAP均可表达.MSCs移植+丹参组植入MSCs的Nestin、NSE分化率更高,且有统计学意义;MSCs移植组和MSCs移植+丹参组GFAP分化率比较差异无统计学意义.结论 MSCs植入HIBD新生大鼠脑组织后能存活,并在脑组织中移行,植入MSCs主要在HIBD新生鼠左侧脑皮质、海马等部位分化为神经细胞,表达Nestin、NSE及GFAP,加用丹参后可促进植入MSCs表达Nestin及NSE,对GFAP表达无影响.     

脐带血间充质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的疗效

目的探讨混合培养的人脐血间充质干细胞(MSCs)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠的疗效。方法无菌条件下收集20份健康足月新生儿脐血,采用密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞,再通过贴壁细胞培养法培养出人脐血MSCs。当细胞传至第3代时,随机取培养的8份脐血MSCs(半量)为A组,8份脐血MSCs(半量)为B组,将A、B组剩余的半量脐血MSCs混合为C组,3组细胞密度均为1×106L-1。混合培养的第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD105的表达。选择P4代人脐血MSCs作为移植细胞,并经5-溴-2-尿嘧啶脱氧核苷(BrdU)体外标记。7日龄SD大鼠45只制备HIBD模型,造模中死亡3只,余42只分为混合移植组(n=16)、单份移植组(n=16)和对照组(n=10)。造模第3天,在立体定位条件下,移植组大鼠经左侧大脑皮质注入人脐血MSCs,对照组在相同部位注入相同体积的PBS。在细胞移植第7天,随机选择6只移植组大鼠处死取脑,采用免疫组织化学方法观察移植细胞在脑内的存活、迁移和分化情况。移植第1、7、14、21、28天采用改良神经功能损害评分(mNSS)对3组大鼠...     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DCs）的实验方法,实现体外大规模扩增高纯度DCs用于临床免疫治疗。方法E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DCs。不成熟DCs（im-DCs）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ-DR表达。用磷酸酯多糖（LPS）促进DCs成熟,收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查,分析细胞表型并与im-DCs细胞表型做对比,异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果ESC来源DCs呈典型DCs形态学表现。im-DCCD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达低,m-DCCD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达均较前明显升高。功能检测发现,ESC来源DCs具有强烈激发同种异体淋巴细胞增殖的作用,证实ESC来源的DCs具备正常的免疫学功能。结论使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DCs。故ESC可作为DCs来源一条新途径,对于体外大规模制备DCs用于免疫过继治疗提供一个较好的方法。     

胚胎干细胞、成体干细胞向雄性生殖细胞分化的研究进展

胚胎干细胞是一种具有发育全能性的细胞系,理论上可分化成机体的各种组织细胞,包括生殖细胞.成体干细胞是一种多能干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,甚至能打破胚层的界限,横向分化为其他胚层的特化组织细胞,理论上成体干细胞在一定条件下也可分化为生殖细胞.人类胚胎干细胞的研究虽然取得了突破性进展,由于诱导分化技术不成熟,存在免疫排斥、致瘤性和伦理问题等,近期难以用来治疗疾病.与胚胎干细胞相比,成体干细胞则可克服这些缺点,其应用前景日益被看好.由于生殖细胞是遗传物质的传递者,生殖细胞分化的研究具有深刻的科学意义.如果成体干细胞可向雄性生殖细胞分化,应用于临床,那将为治疗男性不育提供了一条新的治疗途径,潜能难以估量.现就胚胎干细胞及成体干细胞向雄性生殖细胞分化方面的研究进展作一综述.     

干细胞向肾脏实质细胞分化的研究进展

随着再生医学的兴起,干细胞移植已成为医学领域的研究热点.干细胞移植作为一门新的治疗方法,目前在临床上已广泛应用于血液系统、肿瘤及自身免疫性疾病.而对于肾脏疾病的治疗目前还多处于实验研究阶段.现对近年来关于干细胞向肾脏实质细胞分化的文献进行回顾分析.     

成年大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为NSE阳性细胞

目的：　研究成年大鼠骨髓基质细胞 (MSCs)在体外分化为NSE阳性细胞的方法。方法：　采用 β -巯基乙醇预诱导MSCs24h,再诱导5h。神经细胞特异性烯醇化酶 (NSE)免疫细胞化学染色鉴定、计数诱导前后的细胞。结果：　诱导后MSCs形态改变,胞体呈锥形,突起交织成网。免疫细胞化学染色NSE表达率达到 (6 3.7±4.5) %。结论：　β -巯基乙醇可以诱导成年大鼠MSCs在体外分化成为NSE阳性细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为胰岛素分泌细胞(英文)

目的：探索大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的方法。为解决胰岛移植物来源匮乏这一问题提供新的思路。方法：采用横向分化技术,将成年大鼠骨髓间质干细胞诱导成为胰岛素分泌细胞。间接免疫荧光法鉴定诱导前后细胞nestin、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素及Pdx-1的表达,RT-PCR法检测诱导前后细胞nestin,胰岛素-1,葡萄糖转运子-2,葡萄糖激酶及其转录因子Isl-1,Pdx-1,Pax-4和Pax-6 mRNA的表达;测定24 h胰岛素分泌量和胰岛素刺激实验评价诱导前后细胞的功能。结果：诱导5 h,nestin阳性细胞为(44.6±7.3)％;诱导24 h,nestin阳性细胞增至(61.8±8.4)％;此后,nestin阳性细胞数目开始下降,诱导第14天后,nestin表达基本消失。诱导后的胰岛素分泌细胞可以表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和Pdx-1等蛋白;表达胰岛素-1、葡萄糖转运子-2、葡萄糖激酶及其多种转录因子mRNA;胰岛素分泌量增加;胰岛素刺激实验反应敏感等。而诱导前MSCc不县备上述特点。结论：大鼠骨髓间质干细胞体外可以诱导成为胰岛素分泌细胞,为胰岛移植开辟新的研究思路。     

诱导脐血内皮祖细胞分化成内皮细胞的研究

目的探讨诱导脐血来源内皮祖细胞分化为内皮细胞,分析其用作组织工程心血管修复物种子细胞来源的可行性。方法采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合应用分离脐血单个核细胞,在含有血管内皮生长因子(VEGF)等多种生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学(光镜、电镜)、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源内皮祖细胞分化的内皮细胞进行鉴定。结果从新鲜脐血中得到的单个核细胞数(3.4±2.1)×107/mL。贴壁细胞培养分化过程中形态发生改变,从小圆形变成梭形,最后分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,细胞数量可扩增达107。7 d后免疫荧光检测发现细胞表达内皮细胞特异性标志vWF和VEGFR-2。流式细胞仪分析单个核细胞经诱导分化后细胞表面表达CD133下降,从3.11%±1.05%下降至0.09%±0.02%。透射电镜观察到培养14 d的细胞胞浆中已出现典型的Weibel-Palade小体。结论脐血单个核细胞存在内皮祖细胞,并在体外可诱导分化为内皮细胞,初步具有用作构建组织工程心血管修复物种子细胞的可行性。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞生物学特性和体外杀瘤机制

目的 探讨树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)生物学特性和体外杀瘤机制.方法　从白血病患儿外周血分离单个核细胞,经过γ干扰素(IFN-γ)、抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)、IL-2 诱导并与树突细胞(DC)共培养后,获得DC-CIK.采用MTT法检测DC-CIK对多种白血病细胞株的杀伤作用.在予以10 mg·L-1、20 mg·L-1小鼠抗人淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)单克隆抗体处理后,流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞比例,RT-PCR与Western blot方法检测Foxp3基因表达水平.结果 诱导后的DC-CIK细胞形态规则,其对肿瘤细胞B95、Jhhan、M07e 均表现出杀伤活性.其中对B95细胞的杀伤作用较强,在效靶比为51、101 时DC-CIK对B95细胞的杀伤作用均>60%,而对Jhhan、M07e的作用不明显.在予以10 mg·L-1、20 mg·L-1LFA-1单克隆抗体处理后,与阴性对照组比较,2个处理组均使CD4+CD25+ Treg细胞表达增加(t=6.783、7.282,Pa＜0.05).RT-PCR与Western blot结果表明与阴性对照组比较,2个处理组均使Foxp3基因mRNA表达水平增加(t=11.671、10.909,Pa＜0.05),Foxp3基因蛋白表达水平增加(t=16.734、9.562,Pa＜0.05).结论　DC-CIK具有强大的体外杀瘤作用,Foxp3基因参与LFA-1介导的DC-CIK杀瘤途径,其杀瘤机制表现为CD4+CD25+Treg细胞途径受抑制.     

树突细胞与感染性疾病

树突细胞是一种专职性抗原呈递细胞,在感染性疾病、肿瘤、过敏性疾病、自身免疫性疾病和器官移植等多种疾病的发生发展中扮演着极其重要的角色。树突细胞在不同的条件下具有提高和削弱机体抵抗感染性疾病能力的双重作用。该文仅就树突细胞与病毒、细菌和原虫等感染相互关系中的分子免疫学机制及其在疫苗研发中的积极作用作一综述。     

B细胞及永生B细胞在传染性单核细胞增多症患儿中的动态变化

目的探讨儿童传染性单核细胞增多症(IM)不同时期永生B细胞(CD19 CD23 )及B细胞(CD19 )的变化及其规律。方法在病程急性期,病程1、3、6个月分别采集30例IM患儿外周静脉血2mL,并分离单个核细胞,采用流式细胞术检测IM患儿及健康对照组儿童外周血单个核细胞CD19 CD23 及CD19 分子表达。结果IM患儿急性期CD19 CD23 [(0.24±0.13)%]及CD19 [(3.89±1.32)%]细胞明显降低,与其余各期及健康对照组比较均有显著差异(Pa<0.001);随时间推移及感染控制CD19 CD23 及CD19 逐渐升高,但病程1个月[CD19 CD23 (0.68±0.32)%,CD19 (8.63±2.15)%]仍低于病程3个月[CD19 CD23 (1.60±0.51)%,CD19 (15.27±3.92)%]、病程6个月[CD19 CD23 (1.30±0.50)%,CD19 (14.60±4.80)%]及健康对照组[CD19 CD23 (1.35±0.42)%,CD19 (18.91±3.53)%](Pa<0.001);病程3个月、6个月CD19 CD23 及CD19 细胞比较无显著性差异(Pa>0.05);病程3个月和6个月CD19 CD23 与健康对照组比较无显著性差异(Pa>0.05),但CD19 仍低于健康对照组,有显著性差异(Pa<0.001)。结论IM患儿急性期存在继发性体液免疫功能低下,并持续至临床症状消失后较长时间,该结果为临床应用静脉丙种球蛋白治疗IM提供了理论依据;为探索正常免疫个体永生B细胞被有效控制的机制提供了一个人体模型。