截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段，并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法 利用，VcoI、HindⅢ双酶切，从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段，并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中，构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E．coli BL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni—NTA agarose纯化后，Western—blotting分析其免疫反应性。结果 成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1，通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白，相对分子质量40000，Western—blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性，ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段，表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别，有望成为一种有价值的诊断抗原。     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

重组GRA5蛋白免疫诊断弓形虫病价值的研究

目的 原核表达的刚地弓形虫致密颗粒蛋白5(rGRA5)免疫诊断价值的探讨.方法 GRA5基因在RT-PCR被扩增,构建pET28a-GRA5原核表达载体,双核酸内酶切及序列测定进行鉴定,pET28a-GRA5IPTG诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot法检测该重组蛋白的表达.建立以纯化的重组蛋白的间接ELISA法,检测收集样本血清中弓形虫特异性抗体.结果 PCR反应扩增出为363 bp大小的GRA5基因,所构建的pET28a-GRA5原核表达载体经双酶切显示插入片段大小与上相符,DNA测序结果表明与GenBank中录入的GRA5基因经Blast比对序列同源性100%,原核细胞表达的该重组蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有显示(约14 ku).本实验建立的ELISA法检测的100例弓形虫感染者(血清学阳性)血清中有73例呈阳性,阳性率为73.0%(73/100),其中40例IgG阳性标本的阳性率为72.5%(29/40),30例IgM阳性标本的阳性率为53.3%(16/30),30例IgG、IgM均阳性标本的阳性率为93.3%(28/30),30例阴性血清标本的阳性率仅为6.7%(2/30).结论 本实验获得的原核表达的rGRA5具有一定的弓形虫病免疫诊断的潜在价值.     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白基因的表达及其融合蛋白免疫反应性的评价

目的 将亚克隆在pET32a( )质粒上的日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白(calcium-binding protein，CBP)基因进行表达及蛋白纯化。并对表达产物用Westem blotting及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法 将重组表达质粒pET328( )-CBP转化人宿主菌BL2l中，IPTG诱导表达后超声裂菌，离心后取上清进行SDS-PAGE，观察融合蛋白的表达情况；用金属Ni鏊合物亲和层析树脂(Ni-NTA)柱子纯化目标蛋白；将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上，分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹，将纯化后的融合蛋白作为包被抗原，ELISA法检测正常兔血清及感染兔血清，对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果 重组菌株用IPTG诱导后于Mr=29000处有一表达条带，该蛋白与硫氧还蛋白融合表达，带有6-His基团，用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的反应条带，而用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹都没有特异性的目标反应带出现，ELISA的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清没有免疫反应性。结论 CBP蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且相对分子质量约为29000，该蛋白与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清均无免疫反应性，这可能与该蛋白为尾蚴期特异性抗原有关。     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白基因的表达及其融合蛋白免疫反应性的评价

目的将亚克隆在pET32a( )质粒上的日本血吸虫Mr为8 000钙结合蛋白(calcium-binding protein, CBP) 基因进行表达及蛋白纯化,并对表达产物用Western blotting 及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法将重组表达质粒pET32a( )-CBP 转化入宿主菌BL21中,IPTG诱导表达后超声裂菌,离心后取上清进行SDS-PAGE,观察融合蛋白的表达情况;用金属Ni鏊合物亲和层析树脂(Ni-NTA)柱子纯化目标蛋白;将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上,分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹,将纯化后的融合蛋白作为包被抗原,ELISA法检测正常兔血清及感染兔血清,对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果重组菌株用IPTG诱导后于Mr=29 000处有一表达条带,该蛋白与硫氧还蛋白融合表达,带有6-His基团, 用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的反应条带,而用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹都没有特异性的目标反应带出现,ELISA 的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清没有免疫反应性。结论CBP蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且相对分子质量约为29 000,该蛋白与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清均无免疫反应性,这可能与该蛋白     

重组弓形虫GRA7的纳米金免疫传感器检测弓形虫GRA7抗体

目的:建立基于重组弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)的纳米金免疫传感器检测血清GRA7抗体,评价其检测性能.方法:体外合成gra7基因,构建重组表达质粒pQE-60-gra7,表达并纯化GRA7,Western blot鉴定其免疫活性;种子生长法制备金纳米棒,构建GRA7的纳米金免疫传感器检测人血清GRA7抗体,评价其灵...     

人类新基因era基因组织分布的免疫组织化学研究

目的为了研究人era基因这一人类新基因表达产物的组织分布情况.方法根据人era序列设计并合成扩增引物,用PCR法从pUC19-hera质粒中扩增人era基因(h-era)全长cDNA和h-ERAC端的结构域基因,并分别克隆到(His)6融合表达载体pRSET-C和非融合表达载体pDH中,诱导表达(His)6-h-ERA融合蛋白和h-ERAC端结构域蛋白.用h-ERAC端结构域蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗h-ERA抗血清.用Western-b10t对兔抗h-ERA抗血清.进行了鉴定,并成功地制备了兔抗h-ERA血清.利用在大肠杆菌中高表达、纯化的(His)6-h-ERA融合蛋白,对已制备的兔抗人ERA抗血清进行进一步鉴定纯化获得抗h-ERA的特异性多抗;再对4月～5月人胎儿心、肝、肺、脾、肾等脏器和胃、小肠、睾丸、胸腺、胰脏及胆囊进行免疫组织化学染色.结果在人类4月～5个月胎儿心、肝、肺、脾、肾脏等脏器和胃、小肠、睾丸中均有免疫反应阳性产物出现.胰脏、心、肺脏等呈高表达,脾脏、胃、小肠呈中等表达,睾丸、肝脏、肾脏呈低表达,胆囊、胸腺无免疫阳性表达产物出现.结论人ERA在人类正常胎儿不同组织中有表达,但人ERA蛋白在各种组织中分布情况有差异,可能是一种新型功能蛋白.     

重组钩端螺旋体多抗原位点同源合成基因的表达及其抗原性鉴定

目的：构建重组钩端螺旋体(钩体)优势抗原表位原核表达系统,以期获得高纯度的钩体优势抗原表位重组融合蛋白,为进一步研究钩体快速检测方法奠定基础。方法：利用基因重组的方法构建表达质粒pET-rLP。经IPTG诱导后,获得高效表达带组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,包涵体蛋白经尿素变性溶解,采用镍离子亲和纯化,利用SDS-PAGE、Western blotting和间接ELISA法鉴定。结果：在相对分子质量为20 000处有1条特异性蛋白条带,为重组钩体优势抗原表位融合蛋白;ELISA结果显示其可与钩体阳性血清特异性结合,而与其他血清无交叉反应。结论：成功构建重组钩体优势抗原表位原核表达系统,并获得高纯度的重组钩体优势抗原表位融合蛋白。     

旋毛虫膜蛋白新基因Tmp10的免疫筛选及鉴定

目的免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,寻找抗旋毛虫病的疫苗候选抗原或诊断抗原。方法应用旋毛虫感染的猪血清免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,获得阳性克隆。将一阳性克隆与原核表达载体p ET-28a(+)构建重组质粒,异丙醇硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导后,利用亲和层析柱纯化目的蛋白,并通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blotting鉴定其抗原特异性和免疫原性。结果免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得42个阳性克隆,选取一个新基因Tmp10,成功构建了重组质粒p ET-28a(+)/Tmp10,诱导表达后获得的重组蛋白(r Tmp10)的相对分子质量约为40 000。Western blotting检测结果显示,该重组蛋白可被旋毛虫感染小鼠和猪血清所识别,具有抗原特异性。r Tmp10免疫小鼠可诱导产生高滴度的抗体,显示其具有较好的免疫原性。结论免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得一个新基因Tmp10,生物信息学分析预测其为膜蛋白,其重组蛋白(r Tmp10)具有较好的抗原特异性和免疫原性。     

β溶血性链球菌htra基因的测序鉴定及表达蛋白的免疫反应性分析

【目的】了解广州市儿童致咽炎β溶血性链球菌(BHS)中htra同源基因的分布并初步探讨其表达蛋白在BHS中的免疫反应性。【方法】运用PCR扩增从患儿分离的44株BHS的htra基因并测序,测序结果与NCBI中已知基因序列进行同源性比对;将测序正确的A组链球菌(GAS)htra基因克隆至原核表达质粒pGEX4T-1,并在E.coli BL21中表达,应用Western blot,以抗GST Rabbit mAb鉴定重组融合蛋白表达,以BHS免疫小鼠抗血清检测目的蛋白的免疫反应性。【结果】44株BHS的htra基因与已知GAS htra基因的一致性均达99%;Western blot显示,HtrA融合蛋白可与抗GST Rabbit mAb以及GAS免疫小鼠血清特异性结合,而非A组链球菌及对照组免疫血清则呈阴性结果。【结论】从患儿分离的BHS均携带与GAS相同的htra基因,这与基因库中已知的B组链球菌(GBS)、C组链球菌(GCS)htra序列不符;GAS感染动物后可产生抗HtrA蛋白抗体,可以认为HtrA为GAS的显性免疫原,而尚不能认为非A组链球菌中HtrA为其显性免疫原。     

BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性

目的：构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法：用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS-7细胞,用荧光显微镜检测和Western blotting分析其在COS-7细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一步检测融合蛋白的生物活性。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/pLEGFP构建成功。转染COS-7细胞后,荧光显微镜和Western blotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论：基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的表达纯化及其临床应用的初步研究

目的获得重组幽门螺杆菌（H．pylori）脂蛋白（rLpp20）,并研究其在血清学诊断中的应用价值。方法应用重组质粒pGEX-6P．2／Lpp20在大肠杆菌（E．coli）BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western．blot检测纯化产物（rLpp20）的免疫反应性;以rLpp20为包被抗原建立ELISA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较。结果成功表达的rLpp20（43000Mr）,纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别;成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91．0％,特异度为100％。与试剂盒法比较,两者的符合率为95．5％。结论Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断。     

MiR-126体外调控人脐静脉内皮细胞中表皮生长因子-7基因的表达

目的 研究miR-126对类表皮生长因子域7(EGFL-7)基因表达的调控作用.方法 设计并构建靶向于EGFL-7的miR-126表达质粒,用脂质体转染人脐静脉内皮细胞株ECV-304,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblotting检测EGFL7的mRNA及蛋白表达水平.结果 用miR-126重组质粒转染ECV-304后经qRT-PCR检测发现:转染后pEGFP-N1-GFP/miR-126转染组EGFL7mRNA平均表达水平随时间总体呈降低趋势,48h的表达量最低.Western blot检测发现:重组质粒转染后plegfp-N1-miR-126转染组内皮细胞中EGFL7蛋白相对于β-actin的比率为0.111,相对于空白对照组(0.336)减少了67%,而空质粒转染组(0.314)相对于空白对照组仅减少了6.5%.结论 MiR-126可下调内皮细胞中EGFL-7蛋白水平的表达,为下一步研究EGFL7与肿瘤血管发生机制之间的关系提供了实验依据.     

DHRS7对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及其在乳腺癌组织中的表达

［摘 要］目的：探究 DHRS7基因过表达和DHRS7特异性短发夹RNA(shRNA)重组质粒对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及DHRS7与乳腺癌浸润癌的关系,阐明DHRS7在乳腺癌发生、发展中的作用。方法：利用RT-PCR技术将DHRS7基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1( + )质粒中,构建pcDNA3.1-DHRS7重组真核表达质粒。实验分为pcDNA3.1-DHRS7组、阴性对照组(pcDNA3.1组)、空白对照组和DHRS7-shRNA-pGenesil组,用Fugene HD转染试剂将各种质粒转染MCF-7细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测各组MCF-7细胞中DHRS7的表达情况,流式细胞术分析细胞周期变化,免疫组织化学SP法检测乳腺原位癌和乳腺浸润癌组织中DHRS7蛋白的表达情况。结果：成功构建pcDNA3.1-DHRS7重组表达质粒。PCR和Western blotting结果显示,pcRNA-DHRS7组蛋白的表达量高于空白对照组（P<0.05）,DHRS7-shRNA-pGenesil组蛋白的表达量低于空白对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术显示,DHRS7表达上调使MCF-7细胞S期细胞增多（P<0.05）,DHRS7的表达下调使处于G2期的细胞增多（P<0.05）。免疫组织化学染色显示,DHRS7蛋白在原位癌中高表达,阳性表达率为100%（37/37）;在乳腺浸润癌的表达明显降低,阳性率为18.9%（7/37）,两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：DHRS7基因参与了MCF-7细胞细胞周期的调控过程,可以抑制细胞增殖,DHRS7蛋白的表达丢失可能促进乳腺癌浸润。     

一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白(CsMLP)进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-CsMLP重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论 CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性,其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。