地高辛标记寡核苷酸探针对慢性乙肝患者前C基因突变的检测

目的　研究慢性乙肝患者乙肝病毒（ＨＢＶ）前Ｃ区突变情况。方法　用多聚酶链反应（ＰＣＲ）结合地高辛标记的寡核苷酸探针Ｍ０（野毒株）、Ｍ１（１８９８位变异株）、Ｍ２（１８９８／１９０１位变异株）对１６５例慢性乙肝患者前Ｃ区突变情况进行检测。结果　其中１２例ＨＢｓＡｇ（＋）,ＨＢｅＡｇ（＋）,抗ＨＢｅ（－）,抗ＨＢｃ（＋）患者,ＨＢＶＤＮＡ阳性率为１００％,突变株检出率为８．３％。１５３例ＨＢｓＡｇ（＋）,ＨＢｅＡｇ（－）,抗ＨＢｅ（＋）,抗ＨＢｃ（＋）患者,ＨＢＶＤＮＡ总阳性率为１６．３％,突变株总检出率为８４％。结论　前Ｃ基因突变株主要存在于抗ＨＢｅ阳性的慢性乙肝患者体内,ＰＣＲ结合地高辛标记的寡核苷酸探针杂交技术,操作简便快捷,利于临床推广应用。     

乙型肝炎病毒毒株X基因/C基因启动子的热点变异

目的ＨＢＶ／Ｘ基因存在调控ＨＢＶ复制的调节序列,Ｘ基因变异将影响这些调节序列功能,研究中国ＨＢＶ毒株Ｘ基因／Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）区的变异情况。方法设计ＢＣＰ下游反义链错配引物,将点突变附近的一个碱基（ｎｔ１７６７）由Ａ→Ｔ,则正好可在ＢＣＰ变异株中引进一个ＢｃｌＩ（Ｔ↓ＧＡＴＣＡ）酶切位点,结合限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）筛检１４３例中国人感染的ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区变异,并与前Ｃ区变异比较。结果１１４例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性慢性ＨＢＶ感染者,ＢＣＰ区和／或前Ｃ区变异者４９例（４３％）,ＢＣＰ变异者３７例（３２％）。ＢＣＰ变异无论在ＨＢｅＡｇ阳性或阴性慢性肝炎病例的发生率均显著高于慢性ＨＢＶ无症状感染者。ＢＣＰ可与前Ｃ终码变异共存或单独出现。结论在中国ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区存在热点变异。ＨＢＶ毒株ＢＣＰ变异可能影响ＨＢＶ前Ｃ基因组ｍＲＮＡ转录,是ＨＢＶ感染持续和肝病变进展的原因之一。     

拉米夫定抗HBV效应的临床观察

目的：观察拉米夫定（３ＴＣ）抗ＨＢＶ的启动效应。方法：将４０例慢性乙型肝炎患者分为４组（Ａ～Ｄ）,每组１０例。Ａ组为原干扰素初治无效组（完成疗程,≥４５针）,而此次治疗前ＨＢｅＡｇＣＯＩ≥２０的提示ＨＢＶＣ高复制状态者,以３ＴＣ伍用ＩＦＮα治疗;Ｃ组为初次抗病毒治疗的ＨＢｅＡｇ,ＣＯＩ≥２０的慢乙肝患者,单以３ＴＣ治疗;Ｂ、Ｄ组分别为Ａ、Ｃ组的配对对照组。以ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡ的双阴转率与ＡＬＴ复常率作为完全应答的疗效评估指标。结果：Ａ组的即、近及一年持续的完全应答率分别为６０％、５０％与４０％,疗效明显（Ｐ〈０．０５）;而Ｃ组则为３０％、３０％与２０％,未能提供满意疗效（Ｐ〉０．０５）。结论：对ＩＦＮα初治无效的ＨＢＶ高复制的慢乙肝患者,３ＴＣ伍用ＩＦＮα治疗有效,并提示３ＴＣ有明显的抗ＨＢＶ效应。     

乙型肝炎病毒前C区基因变异的研究

作者应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ｅ系统阳性的慢件乙型肝炎（乙肝）患者血清乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ，筛选出乙肝ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）阳性／乙肝ｅ抗体（抗—ＨＢｅ）阴性和ＨＢｅＡｇ阴性／抗—ＨＢｅ阳性各２０份ＰＣＲ阳性血清，分别用人工合成的ＨＢＶ前Ｃ区基因寡核苷酸探针Ｍ０（无突变），Ｍ１（１点突变），Ｍ２（２点突变）进行斑点杂交，结果发现ＨＢｅＡｇ阴性／抗—ＨＢｅ附性慢性乙肝患含有１７例（占８５％）在１８９６位核苷酸发生点突变，形成终止密码，其中１０例（占５０％）发生２点突变。选突变ＰＣＲ产物直接测序，同样证实点突变的存在。提示乙肝患含ＨＢｅＡｇ阳性自然转换为抗—ＨＢｅ阳性、并不一定是病毒复制减弱，而可能足ＨＢＶＤＮＡ前Ｃ区发生了基因变异。     

乙肝病毒标志物阳性产妇母乳喂养的研究

目的：探讨乙型肝炎（ 乙肝） 病毒携带孕妇胎儿宫内感染率和乳汁中乙肝病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 阳性率的相关性,分析研究乙肝血清学指标阳性产妇是否适于哺乳。方法：对５２ 例乙肝血清学指标阳性的产妇,应用酶联免疫吸附法和斑点杂交法分别检测脐血和初乳中的 Ｈ Ｂ Ｖ 标志物（ Ｈ Ｂ Ｖ Ｍ） 以及 Ｈ Ｂ Ｖ 脱氧核糖核酸（ Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ） ,并对比分析。结果：孕妇 Ｈ Ｂ Ｖ 阳性与相应的脐血和初乳中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｍ 阳性率以及 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的检出率呈高度的一致性（ Ｐ ＞ ００５） 。５２ 例 Ｈ Ｂ Ｖ Ｍ 阳性的孕妇中,脐血和初乳中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的检出率均以乙肝表面抗原（ Ｈ Ｂｓ Ａｇ） 、乙肝ｅ 抗原（ Ｈ Ｂｅ Ａｇ） 及乙肝核心抗体（ Ａｎｔｉ Ｈ Ｂｃ）３ 项阳性者最高（８５７１ ％ 和９２８６ ％ ） , Ｈ Ｂｓ Ａｇ 、 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 双项阳性者次之（８０ ％ ） , Ｈ Ｂｓ Ａｇ 单项阳性者最低（２０ ％ ） 。结论： Ｈ Ｂ Ｖ 宫内传播以及初乳排毒率与母亲的 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 和 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 状态密切相关。直接检测初乳中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 为指导哺乳的最可靠方法。血中 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 、 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 和 Ａｎｔｉ Ｈ Ｂｃ３ 项阳性以及 Ｈ Ｂｓ     

应用PCR-ASO技术检测乙型肝炎病毒基因前C区突变

应用碱性磷酸酶标记的ＡＳＯ探针杂交技术对１２３例临床各型乙肝病毒（ＨＢＶ）感染后的血清标本ＰＣＲ后检测了ＨＢＶ基因前Ｃ区１８９６位已知的Ｇ－Ａ点突变株。结果表明：在ＨＢｅＡｂ阳性血清中发现有Ｗ２８Ｘ突变株，而ＨＢｅＡｇ阳性血清样本中未发现该突变株；有突变株的患者亦未全部表现为重症肝炎。提示ＨＢＶ基因前Ｃ区突变并不一定导致病情加重。野生株、突变株与肝炎重症化之间的关系有必要在临床过程中慎重地观察。     

儿童特发性血小板减少性紫癜病因学的初步研究

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 技术对３２ 例急性特发性血小板减少性紫癜（ Ｉ Ｔ Ｐ） 患儿的外周血进行了人细小病毒 Ｂ１９（ Ｈ Ｐ Ｖ Ｂ１９） 、 Ｅ Ｂ 病毒（ Ｅ Ｂ Ｖ） 、巨细胞病毒（ Ｃ Ｍ Ｖ） 及乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 系列检测。结果：病例组 Ｈ Ｐ Ｖ Ｂ１９ Ｄ Ｎ Ａ 阳性８ 例（２５ ．０ ％ ） ,与正常对照组比较有显著性差异（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。 Ｅ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 阳性２ 例, Ｃ Ｍ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 阳性３ 例, Ｈ Ｂｓ Ａｇ 和 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 同时阳性２ 例,４种病毒的总阳性率为４６ ．９ ％ （１５／３２ 例） 。提示：近半数儿童 Ｉ Ｔ Ｐ 病例的发生可能与上述病毒感染有关,而 Ｈ Ｐ Ｖ Ｂ１９ 较其他病毒与 Ｉ Ｔ Ｐ 的关系更为密切。     

乙肝患者血清HBV—DNA与e,c系统相关分析及临床意义

对３７４乙型肝患者血清用地高辛探针法检测ＨＢＶ－ＤＮＡ；用酶联法检测ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ、ＨＢｃＡｇ、抗ＨＢｃ－ＩｇＭ。结果：ＨＢＶ－ＤＮＡ与ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ无明显相关（Ｐ〉０．０５），与ＨＢｃＡｇ、抗ＨＢＣ－ＩｇＭ呈正相关关系（ｒ＝０．１８－０．２，Ｐ〈０．０１）；ＨＢｅＡｇ组与抗ＨＢｅ组ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率无明显差异（Ｐ〉０．０５），以ＨＢＶ－ＤＮＡ为标准评价ＨＢｅＡｇ、ＨＢ     

PCR与ELISA在检测乙型肝炎病毒标志物中的应用比较

目的：观察ＰＣＲ与ＥＬＩＳＡ法在检测乙肝病毒标志物中的差异。方法：用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ法对８０３例疑似乙肝者做了ＨＢＶＤＮＡ和乙肝五项指标检查，并进行比较。结果：在ＨＢｓＡｇ（＋）的７３６例中ＨＢＶＤＮＡ阳性率５８．７７％。ＨＢｅＡｇ（＋）的３５３例中ＨＢＤＮＡ阳性率为９６．３％。ＨＢｅＡｇ（－）的４０８例中ＨＢＶＤＮＡ阳性率为２３．０％。ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ均（－）的２５例中ＨＢＶＤＮＡ阳性率     

乙型肝炎病毒在成人膜性肾病中的致病作用

为了进一步了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）在成人膜性肾病（ＭＮ）发病中的作用。作者应用免疫组化方法对６７例ＭＮ，患者肾组织中的ＨＢＶ抗原进行了检测。年龄小于３０岁者２６例，３０～５０岁者３２例，大于５０岁者９例。肾组织中ＨＢＶ抗原检出率分别是７３．１％（１９／２６），７５％（２４／３２）和３３．３％（３／９）。５０岁以上ＭＮ患者肾组织中ＨＢＶ抗原检出率显著低于５０岁以下年龄组（Ｐ＜０．０５）。ＭＮ患者肾组织中以ＨＢｓＡｇ检出串最高，６７．２％（４５／６７），ＨＢｃＡｇ检出率２２．４％（１５／６７），ＨＢｅＡｇ仅１例阳性；ＨＢＶ抗原总阳性率６８．７％（４６／６７）。以３０例系膜增殖性肾炎（ＭｓＰＧＮ）为对照，ＨＢｓＡｇ检出率１０％（３／３０），ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ均为阴性。ＨＢＶ抗原总阳性率１０％（３／３０）。ＭＮ组肾组织内ＨＢＶ抗原检出率显著高于ＭｓＰＧＮ组（Ｐ＜０．０１）。本研究结果显示，ＨＢＶ抗原及其相应抗体形成的免疫复合物在膜性肾病，特别是中青年患者的发病机理中起着极其重要的作用，其中ＨＢｓＡｇ可能是最主要的致病抗原。     

乙型肝炎病毒核心启动子热点突变与HBeAg存在状态

目的 :研究乙型肝炎病毒 (HBV)核心启动子 (BCP)区 176 2位和 176 4位热点突变对HBeAg存在状态的影响。方法 :采用错配引物的PCR结合限制性内切酶技术检测 90例不同HBeAg状态的HBV无症状携带者的HBVBCP热点突变。结果 :6 0例HBeAg阴性者中HBVBCP热点突变者 2 6例 (4 3.3% ) ,其中 2 0例伴有HBV前C区 (Pre C)区1896位热点突变 ;30例HBeAg阳性者中仅 3例 (10 % )出现HBVBCP热点突变 ;无HBVPre C区热点突变者中 ,19例HBeAg阴性者有 6例存在HBVBCP热点突变 (31.6 % ) ,2 8例HBeAg阳性者仅 2例有HBVBCP热点突变 (7.1% ) ,两组间比较差异具显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :HBVBCP热点突变在HBeAg阴性HBV感染者中较常见 ,且常伴有HBVPre C区 1896位突变 ,HBVBCP热点突变可能是HBeAg阴性的另一原因     

Hot spot mutations of hepatitis B virus pre-C/C gene and its promotor in Chinese patients and the clinical implications

OBJECTIVE: To study if the functions of C gene and its promotor are related to the pathogenesis of hepatitis B and to describe their hot spot mutations in Chinese patients. DATA SOURCES: We have studied this subject in recent years. A mini-review is based on some unpublished works. DATA SELECTION: The sequence data of C gene and core promotor (cp) of hepatitis B virus (HBV) were analysed in the asymptomatic carriers (AsC) and the patients of hepatitis with various severity. RESULTS: Pre-C A1896 mutation occurred in 67% of anti-HBe-positive and 38% of HBeAg-positive cases. All were chronic infections. In C gene, 8 missense mutations in the segment of codon 48-60, and 28 in codon 84-101 were found, more in severe patients. The cp mutations of nt 1762 and nt 1764 occurred more in HBeAg-negative than in positive cases (49% vs 20%), and more in patients than in AsC (56% vs 10%). CONCLUSIONS: A1896 often occurred in nature infection course. The cp and clustering C gene mutations would more frequently lead to prolonged active infection and advanced liver diseases.     

基因芯片检测慢性乙肝患者HBV-DNA变异的临床研究

目的应用新型基因芯片研究乙肝病毒多点基因变异在慢性乙肝患者中的意义，为临床诊断和治疗提供依据。方法对132例慢性乙肝患者采用DNA芯片技术，检测HBV—DNA基因6个位点的变异。结果132例慢性乙型肝炎患者均存在HBV—DNA位点的变异，其中前C区1896G—A变异率为23．5％。e抗原阳性者占4．O％（4／74）。e抗体阳性者占48．3％（28／58），后者变异株显著高于前者，此突变有助于HBV逃避免疫攻击而形成慢性感染状态；前C区1814变异率为3．8％；C区启动子1762变异率为56．1％，1764变异率为53．8％，且两种变异常同时出现，与重型肝炎、肝硬化和肝癌的发生相关；P区528变异率为9．8％，552M—I变异率38．6％，552M—V变异率为10．6％，552变异与核苷类似物耐药相关。结论HBV—DNA位点变异对于判定疾病的稳定与进展有重要作用。     

慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义

目的阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC)点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义。方法慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例。Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序。直接测序失败者,回收目的 DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序。DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析。结果 Bcp/pc区点突变包括nt1753、nt1762、nt1764、nt1776、nt1803、nt1846、nt1896。HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%。A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%。克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%。HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05)。Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系。肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率最高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1%及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05)。结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素。Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究。     

酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究

目的：探讨酒精对HBV DNA多位点基因变异的影响,为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取45例慢性乙肝患者为研究对象,分为嗜酒组和非嗜酒组,采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区1896及1814位点、BCP区1762及1764位点、P区528及552位点的基因变异。结果:嗜酒组在BCP区1762 、1764位点的变异率明显高于非嗜酒组(P均＜0.05)。在前C区1896、1814位点,P区528、552位点变异率差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论:酒精可导致乙肝病毒BCP区1762 、1764位点发生基因突变,BCP区基因变异可促进HBV在人体内的复制表达,加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

HBV变异对乙肝病毒标志物和DNA定量的影响

目的：了解无锡地区HBV前C／C基因变异情况,探讨基因变异对乙肝病毒标志物（HBVM）及HBV DNA定量的影响。方法：HBVM用时间分辨荧光定量试剂检测;HBV DNA定量PCR以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测;HBV DNA前C／C测序使用①德国Roche Mag NA Pure LC全自动核酸提取,加样系统;②美国Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。结果：92例乙肝患者血清中有41例（44．6％）发生前C／C区nt1896位变异,41例中有34例HbeAg阴性,7例HbeAg仍为阳性;以nt1896位是否变异分组,变异组和未变异组HBV DNA定量无显著性差异。结论：nt1896位变异导致HBeAg转阴,HBV病毒变异对HBVM有决定性的影响,但该变异对HBV复制无影响。     

乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片的临床应用

目的:评价临床应用乙型肝炎病毒(HBV)基因多态性芯片(中科院上海微系统和信息技术研究所等研制),检测HBV基因前C区1896、1814,基本C区启动子(BCP)1762和1764,P区的YMDD基序552位等的点突变的效能。方法:以该芯片检测49例不同临床类型乙型肝炎病人血清,并对部分血清的PCR扩增产物进行测序分析。结果:HBV前C区1896位在血清HBeAg阳性病例中,野生株、混合(野生/突变)株、突变株和未确定(无杂交信号)的检出率,分别为57.7％,38.5％,0和3.8％;血清抗HBe阳性病例中,相应为33.3％,22.2％,33.3％和11％,后者突变株显著高于前者(P<0.01)。所有病例HBV前C区的1814位均为野生,未检出突变。BCP 1762和1764双突变在慢性重型肝炎和肝炎肝硬化的检出率分别为66.7％和69.2％,显著高于慢性肝炎的19%(P<0.01)。10例拉米夫定治疗6月以上,HBV DNA仍阳性者中,7例检出P区YIDD或YVDD突变,1例兼有YIDD和YVDD突变,余2例无杂交信号。7例1 896,4例BCP,6例YMDD的测序和芯片检测结果一致,6例无信号位点的测序结果显示,这些位点附近,出现了与杂交探针错配的突变。结论:初步结果提示,该芯片适用于临床检测HBV前C区、P区一些已知热点的突变,并可用于研究这些突变与疾病严重性,及产生抗HBV药物耐药间的相互关系。     

乙肝病毒前C/C区基因一级结构及变异特征的临床探讨

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因突变与HBV-DNA水平及转氨酶的关系;方法:收集慢性乙型病毒性肝炎患者血清423份,进行前C/C区基因测序、HBV标志物、HBV-DNA、ALT、AST测定.结果:HBVnt1896突变毒株158例,nt1899突变毒株57例.C区变异大部分集中在第5、27、60位氨基酸的...     

治疗基线乙型肝炎病毒BCP区和PC区变异对拉米夫定耐药预测的探讨

目的探讨慢性乙型肝炎患者治疗基线乙型肝炎病毒(HBV)BCP区和PC区基因变异对拉米夫定耐药的影响。方法收集接受拉米夫定(100mg/片)初治2年内耐药的26例(耐药组)和2年内无耐药的16例(对照组)慢性乙型肝炎患者治疗基线的血清标本,采用型特异性多引物对巢式PCR法检测HBV基因型,用PCR产物直接测序技术检测治疗基线HBV的BCP区、PC区和P区变异位点,对发生频率较高的两组位点变异进行统计学分析。结果两组病人无1例发生P区rt204/180变异;在HBV BCP/PC区突变中,耐药组与对照组在点突变A1762T(38.48%vs 68.75%,P>0.05)、G1764A(26.92%vs50.00%,P>0.05)和G1896A(19.23%vs 18.75%,P>0.05)差异无统计学意义;对照组在点突变C1799G(43.75%vs 0,P<0.05)、T1802C(18.75%vs 0,P<0.05)、G1838A(25.00%vs 0,P<0.05)、A1846C(37.50%vs 0,P<0.05)、C1856T(31.25%vs 0,P<0.05)、G1888A(25.00%vs 0,P<0.05)明显高于耐药组。结论治疗基线HBV BCP区的A1762T/G1764A变异和PC区的G1896A变异对拉米夫定的2年疗效影响不大;治疗基线HBV BCP区的C1799G、T1802C、G1838A、A1846C的变异和PC区的C1856T、G1888A的变异可能是接受拉米夫定初始治疗获得长期维持应答的预测因素之一。