新霉素对大鼠前庭毛细胞损伤作用的实验研究

目的 研究新霉素对大鼠前庭毛细胞的毒性作用,为药物性前庭功能障碍动物模型的制备和相关研究提供参考.方法 将15只成年Wistar大鼠分为正常对照组(n=5)、新霉素组(n=5)和人工外淋巴液组(n=5),新霉素组大鼠在右耳通过耳蜗底转鼓阶打孔的方法在耳蜗内注入0.1%(g/100ml)新霉素5μl,人工外淋巴液组按同样方法注入人工外淋巴液5μl.正常对照组大鼠不做任何处理.处理3天后对动物进行颈髓硬膜外短声诱发电位(click-evoked potential on the surface of the cervical dura mater,CDM-CEP)检查和游泳试验以评价前庭功能;然后将动物处死,进行形态学观察.结果 3天后新霉素组大鼠的前庭毛细胞即出现严重破坏,并出现严重的前庭功能损伤.正常对照组大鼠的游泳时间为(4.0±0.71)8(3～5s,n=5),新霉素组大鼠的游泳时间为(10.2±1.64)8(8～12s,n=5),人工外淋巴液组大鼠的游泳时间为(4.4±1.14)s(3～6s,n=5);在短音(click)刺激下,正常大鼠引出CDM-CEP的阈值为(85±3.54)dB SPL(80-90 dB SPL,n=5),阈值时的潜伏期为(6.59±0.41)8(6.05～7.05s,12=5);新霉素组大鼠120dB SPL仍无法引出CDM-CEP;人工外淋巴液组大鼠引出CDM-CEP的阈值为(90±5.0)dB SPL(85-95 dB SPL,n=5),阈值时的潜伏期为(6.68±0.31)s(6.35～7.02s,n=5).结论 新霉素对大鼠前庭毛细胞具有极强的破坏作用,新霉素耳蜗内注射的方法可以制备理想的前庭功能障碍动物模型.     

Math1基因导入成年大鼠前庭有效途径的探索

目的探索Math1基因导人大鼠前庭简便有效的方法和途径,为前庭功能障碍基因治疗的相关研究提供参考。方法将20只成年Wistar大鼠分为缺失E1、E3基因片段且构建有Math1基因和增强型绿色荧光蛋白报告基凶的复制缺陷型腺病毒（adnovirus—Math1—enhanced green fluorescence protein,Ad—Math1—EGFP）鼓阶导入组和前庭阶导人组．Ad—Math1—EGFP导入组大鼠在右耳通过耳蜗底转鼓阶或前庭阶打孔的方法导人物理滴度为2．1×1011v．p／ml的上述腺病毒5μl。在导入3天、7天后分别将动物处死,进行GFP表达观察。结果导入Ad—Mathl—EGFP3天后,前庭阶导入组大鼠的前庭终末器官及耳蜗均出现明显的GFP阳性表达;而鼓阶导入组的表达则局限于耳蜗,7天后仍未见前庭终末器官的GFP阳性表达。结论耳蜗底转前庭阶打孔可以作为Math1基因导入大鼠前庭简便有效的途径。     

碱性成纤维细胞生长因子对前庭毛细胞的保护作用

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子对新霉素所致离体椭圆囊毛细胞损害的保护作用。方法 采用离体的豚鼠椭圆囊培养法,对照组为普通前庭培养液培养,实验组按培养液中含和不含ｂＦＧＦ分组,用新霉素造成各实验组２的椭圆囊毛细胞损伤,各组椭圆均行扫描电镜检查并行毛细胞计数。结果 含ｂＦＧＦ的实验组毛细胞的存活数目显著高于不含ｂＦＧＦ的实验组,对照组无缺失或损伤。结论新霉不对离体的椭圆囊毛细胞的有罗强的破坏作用,ｂ     

硫酸新霉素对新生大鼠离体培养耳蜗毛细胞的毒性作用研究

目的观察体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器经不同浓度硫酸新霉素处理后,各回毛细胞损伤情况。方法取新生大鼠完整耳蜗基底膜,体外培养12小时,存活贴壁后加药处理。对照组10个样本;3个实验组各10个样本,分别用终浓度为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L硫酸新霉素处理24小时。进行MyosinⅦa免疫荧光组织化学染色,在共聚焦显微镜下观察各回毛细胞缺失情况。分别选取10个图片进行毛细胞计数（每张图片截取100μm计数毛细胞个数）,并利用CHISS软件进行统计分析。对照组除不加入硫酸新霉素外,其他培养条件均与实验组相同。结果硫酸新霉素对离体培养的新生大鼠耳蜗毛细胞具有损伤效应,且外毛细胞对硫酸新霉素的毒性作用比内毛细胞敏感。加入硫酸新霉素后,耳蜗毛细胞损失从底回外毛细胞开始,随着药物浓度增加,逐渐累及到中回,最后顶回受累,且损失程度随着浓度的递增而加重,以外毛细胞为甚。单纯体外培养的耳蜗毛细胞没有缺失。经完全随机设计方差分析可得：顶回正常组内毛细胞数量与新霉素1mmol/L组、2mmol/L组无统计学差异,与新霉素4mmol/L组有统计学差异;中、底回正常组内毛细胞数量与新霉素1mmol/L组、新霉素2mmol/L组、新霉素4mmol/L组均有统计学差异;顶回正常组外毛细胞数量与新霉素2mmol/L与4mmol/L组有统计学差异;中、底回正常组外毛细胞数量与新霉素1mmol/L组、新霉素2mmol/L组、新霉素4mmol/L组均有统计学差异。结论新生大鼠体外培养的耳蜗毛细胞随着硫酸新霉素药物浓度的增加损失越严重,且从底回向顶回发展,此与活体动物实验的损害规律基本相同,因此可作为耳毒性药物损伤后毛细胞再生研究的体外模型。     

豚鼠壶腹嵴感觉细胞损伤与修复过程对前庭功能的影响

为观察庆大霉素损伤后豚鼠壶腹感觉细胞损伤与修复对前庭功能的影响，探讨前庭感觉上皮细胞损伤后自发修复与前庭功能恢复的关系。实验组动物连续１２天皮下注射１２５ｍｇ／ｋｇ庆大霉素，应用正旋摆支实验和旋转实验连续观察前庭功能的变化，结合没存活时间动物水平半规管腹嵴的扫描电观察和半薄切片壶腹嵴顶部不工毛细胞的定量分析，结果示：停药第２２天的１０只动物中有４只动物前庭功能有一定程度的恢复，但仍有明显前庭功能低     

豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性钾电流的钙离子依赖性

目的研究豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)敏感性钾电流对钙离子的依赖性。方法应用全细胞膜片钳技术研究新鲜单离的豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性钾电流在细胞内外钙离子浓度改变时其电流幅值的变化。结果①细胞外ACh激活一缓慢持久的外向性钾电流,其反转电位为(-70±10)mV;②ACh-敏感性钾电流电流对细胞外四乙胺(10mmol/L)敏感,而对细胞外4-氨基吡啶(100μmol/L)不敏感;③ACh-敏感性钾电流的幅值大小依赖于细胞外的钙离子浓度,无钙外液中ACh激活一很小的电流,4mmol/L外钙溶液中ACh-敏感性钾电流的幅值达到最大值,而0·5mmol/L外钙溶液中ACh-敏感性钾电流的幅值抑制至(36·5±6·5)%;④细胞内三磷酸肌醇-钙离子释放过程不参与ACh-敏感性钾电流的激活,细胞内透析肝素8mg/ml后30min,ACh-敏感性钾电流的幅值没有明显改变;⑤ACh敏感性钾电流对钙通道阻断剂Cd2+敏感。结论豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性钾电流的激活依赖于细胞外的钙离子浓度,ACh与豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞胆碱能受体结合后,首先激活膜上钙通道引起细胞外钙离子内流,毛细胞内游离钙离子浓度的升高进一步激活钙依赖性钾电流。     

豚鼠前庭感觉上皮损伤中细胞凋亡的观察

细胞凋亡对细胞增殖、器官发生和功能维持起着重要作用。一定剂量的庆大霉素连续注射，造成豚鼠前庭器官损伤。采用半薄切片，透射电镜（ＴＥＭ）和ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ－ｍｏｄｉｄｅｄ ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ－ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ，末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素标记）原位杂交技术，特异标记ＤＮＡ片段３＇－ＯＨ末端，原位显示凋亡细胞。在半薄切片和ＴＥＭ观察中发现两种类型的细胞损伤方式：①毛细胞肿胀     

慢性庆大霉素损伤后豚鼠前庭上皮细胞的凋亡和再生观察

目的：观察慢性庆大霉素中毒后豚鼠前庭上皮的损伤和修复过程，探讨前庭毛细胞凋亡和再生的关系。方法：采用末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terninal deoxyuncleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL）法，观察前庭感觉上皮细胞的凋亡，采用5′-溴-2-脱氧尿苷（bromodeoxyuridine，Brdu）免疫细胞化学法观察前庭上皮的再生过程。结果：对照组没有观察到TUNEL和Brdu阳性细胞。停止庆大霉素注射1天至3周均可观察到TUNEL阳性细胞，但1天组阳性细胞数量最多，3周仍有阳性细胞存在，阳性细胞主要位于毛细胞层。停止庆大霉素注射后1天组支持细胞层和毛细胞层均有Brdu标记阳性细胞，3d组支持细胞层阳性细胞显著增多，1周组毛细胞层也出现较多阳性细胞，2周组Brdu标记阳性细胞主要位于毛细胞层，3周仍可观察到Brdu标记阳性细胞。结论：慢性庆大霉素耳中毒后豚鼠前庭上皮细胞凋亡增加，凋亡与增殖伴随存在，前庭毛细胞的损伤可能是其增殖的触发因素。增殖过程表现为支持细胞增生向毛细胞增生移行的趋势，支持细胞增殖并转化成毛细胞可能是前庭上皮细胞损伤修复机理之一。     

豚鼠前庭感觉上皮损伤中细胞凋亡的观察

细胞凋亡对细胞增殖、器官发生和功能维持起着重要作用。一定剂量的庆大霉素连续注射，造成豚鼠前庭器官损伤。采用半薄切片，透射电镜（TEM）和TUNEL（TdT－modidedbiotin-dUTPNick-endlabeling，末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素标记）原位杂交技术，特异标记DNA片段3′－OH末端，原位显示凋亡细胞。在半薄切片和TEM观察中发现两种类型的细胞损伤方式：①毛细胞肿胀，胞浆空泡化，细胞体从顶端表面挤出；②毛细胞在上皮内变性，显示出细胞凋亡的形态特征，包括细胞核凝缩，核膜消失，成碎块状，并由支持细胞吞噬。原位杂交显示：细胞凋亡标记阳性细胞主要分布在上皮表层，较高水平标记主要发生于给药后第3到7天。提示细胞凋亡是内耳前庭感觉细胞损伤的一种重要方式，凋亡的主动发生可能是一种潜在的介入方式来减少氨基甙类抗生素对毛细胞造成的急性损伤，并与感觉上皮损伤后的修复过程有关。     

retrovirus-mediated gene transfer in immortalization of progenitor hair cell lines in newborn rat

Objective To present an experimental method that allows isolation of greater epithelial ridge (GER) and lesser epithelial ridge(LER) cells from postnatal rat cochleae using a combinatorial approach of enzymatic digestion and mechanical separation and to investigate a retrovirus-mediated gene transfer technique for its possibl utility in immortalization of the GER and LER cell lines, in an effort to establish an in vitro model system of hair cell differentiation. Methods GER and LER cells were dissected from postnatal rat cochleae and immortalized by transferring the SV40 large T antigen using a retrovirus. The established cell lines were confirmed through morphology observation, immunnocytochemical staining and RT-PCR analysis. The Hathl gene was transferred into the cell lines using adenovirus-mediated techniques to explore their potential to differentiate into hair cells. Results The established cell lines were stably maintained for more than 20 passages and displayed many features similar to primary GER and LER cells. They grew in patches and assumed a polygonal morphology. Immunostaining showed labeling by SV40 large T antigen and Islet1 (a specific marker for GER and LER). All passages of the cell lines expressed SV40 large T antigen on RT-PCR analysis. The cells also showed the capability to differenti-ate into hair cell-like cells when forced to express Hathl. Conclusion Retrovirus-mediated gene transfer can be used in establishing immortalized progenitor hair cell lines in newborn rat, which may provide an invaluable system for studying hair cell differentiation and regeneration for new treatment of sensory hearing loss caused by hair cell loss.     

经大鼠圆窗膜bFGF基因转导防治爆震性聋的实验研究

目的以阳离子脂质体介导bFGF(basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子)基因,经完整圆窗膜途径转染爆震后的大鼠耳蜗,观察bFGF的表达及其对爆震性聋的防治作用。方法 SD大鼠30只,随机分为四组:空白对照组(n=6),仅接受155dB SPL脉冲噪声暴露20次;EGFP(enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白)对照组(n=8),噪声暴露后即刻导入EGFP/阳离子脂质体复合物;bFGF治疗组(n=8),噪声暴露后即刻导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物;bFGF保护组(n=8),噪声暴露前3天导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物。各组动物分别于噪声暴露前及噪声暴露后1天、3天、7天、14天行ABR阈值测试。噪声暴露后14天耳蜗取材做基底膜铺片,荧光显微镜观察,并做bFGF免疫荧光染色验证bFGF的表达。结果爆震后1天,bFGF保护组ABR阈值低于空白对照组及EGFP对照组,且差异均有显著性意义(P<0.05)。爆震后3天、7天和14天,bFGF治疗组及bFGF保护组ABR阈值均低于两个对照组,且差异有显著性意义(P<0.05)。而爆震前及爆震后bFGF治疗组和bFGF保护组间的ABR阈值差异均无显著性意义(P>0.05)。术后14天,荧光显微镜直接观察及bFGF免疫荧光染色均检测到毛细胞内有bFGF的定位表达。结论将阳离子脂质体介导的bFGF基因经圆窗膜导入大鼠耳蜗能够表达,表达产生的bFGF对爆震所致的耳蜗损害有一定的保护作用,它能够减轻爆震后听。     

腺相关病毒Anc80L65转染成年小鼠椭圆囊的实验研究

目的 探索腺相关病毒载体Anc80L65对正常和不同程度损伤的成年小鼠椭圆囊前庭感觉上皮的转染特性.方法 将6周龄小鼠分为以下三组.1)正常对照组:将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的Anc80L65病毒液(Anc80L65-GFP),经后半规管注射途径导入小鼠内耳;2)中...     

噪声暴露下大鼠行为学和海马促肾上腺皮质激素释放因子蛋白表达的改变

目的观察噪声暴露下大鼠行为学的改变,探讨噪声对生物体情绪行为和听力的负性影响及其可能的发生机制。方法选取行为学指标和ABR反应阈接近的健康大鼠24只,随机分为3组,每组8只。对照组(A组):正常喂养;噪声组(B组):每天固定时间噪声暴露4 h,持续28 d;氟西汀组(C组):噪声暴露的条件和时间与噪声组相同,每天噪声暴露后即腹腔注射剂量为10 mg/kg的氟西汀,持续28 d,噪声暴露前1 d、第7、14、28 d观察大鼠的旷场行为并检测ABR反应阈,实验前后记录大鼠的糖水偏爱百分比,最后断头取脑,剥离大鼠海马,Western-blot法测定各组大鼠海马CRF表达。结果第7、14、28 d,与对照组比较,其它组大鼠的旷场行为表现显著改变,差异有统计学意义(P<0.01);氟西汀组大鼠与噪声组比较,旷场行为差异均有统计学意义(P<0.01)。噪声暴露28d后,与对照组相较,噪声组和氟西汀组糖水偏爱百分比明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);与噪声组比较,氟西汀组大鼠糖水偏爱明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。随着噪声暴露时间的延长,其ABR反应阈升高,差异有明显统计学意义(P<0.01)。氟西汀组海马CRF的表达较正常组增加,但较噪声组表达降低,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论长期的噪声暴露可使大鼠产生焦虑抑郁样行为,抗抑郁剂能改善这些行为的改变。海马CRF表达的增加可能参与噪声应激所致的大鼠行为学变化。     

纯中药制剂复聪汤对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗毛细胞修复再生的实验研究

目的观察纯中药制剂对庆大霉素致聋动物和耳蜗毛细胞的修复再生作用。方法选用73只健康青年豚鼠,行听力学检查后,53只动物连续肌肉注射庆大霉素(80mg.kg-1.d-1)24～30天致聋(GM组),其间死亡8只,剩余45只随机分成中药治疗组(25只)和致聋后对照组(20只),中药治疗组给予纯中药制剂"复聪汤Ⅰ号"口服液和"复聪汤Ⅱ号"滴耳液治疗,致聋后对照组同法给予生理盐水。另外20只豚鼠作为正常对照组,每天肌肉注射等量生理盐水。在治疗30、60和90天后对GM组两组动物分别行ABR、DPOAE检测,同时,每一时间点处死6只动物,左侧耳蜗行扫描电镜观察,右侧耳蜗铺片行光镜观察和毛细胞计数。结果实验前所有豚鼠的听功能正常;连续注射庆大霉素30天后,GM组豚鼠ABR反应阈值上升到50～80dB SPL,DPOAE幅值降低,光镜和电镜下表现为耳蜗毛细胞纤毛断碎、倒伏、融合和消失,多处毛细胞表皮板肿胀、突起和疱疹样变性,或毛细胞被完全挤出网状板,基底回和第三回耳蜗毛细胞严重消失;中药治疗30天后,80%的耳聋豚鼠的ABR反应阈恢复到30～50dB SPL,DPOAE幅值明显提高;耳蜗铺片和电镜观察显示耳蜗毛细胞数目有一定恢复,组织结构有修复现象,扫描电镜可见再生毛细胞仅出现少量纤毛,而致聋后对照组未发现此种现象;治疗60天后,耳蜗毛细胞数目明显增多,Corti器的毛细胞区有大量的增殖细胞出现,扫描电镜可见成小束的新生纤毛出现在毛细胞缺失部位,同时支持细胞大量增殖;治疗90天后,再生的静纤毛束已基本形成,尤其是耳蜗基底部位的毛细胞明显增多,听功能基本正常。结论纯中药制剂复聪汤对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗毛细胞有一定的修复和再生作用。     

高强纯音声损伤鸡耳蜗后毛细胞再生研究

本文报告给2天日龄雏鸡每日1.5kHz120dBSPL高强纯音暴露8小时，共刺激6天；随后分0.1、2和3周处死动物，其耳蜗基底乳头（Bp)行扫描电镜（SEM）和光镜（LM）观察,结果发现1.5kHz强纯音仅造成鸡Bp基部至中部内侧较窄范围毛细胞损害，毛细胞消失率占30％左右，当恢复1周后，受损处毛细胞迅速再生，至恢复2周后Bp基本正常。证明高纯度纯音损害鸡内耳后受损区毛细胞有再生能力，再生毛细胞发育成熟而使Bp恢复正常形态。     

不同固定液对大鼠耳蜗一氧化氮合酶表达及透射电镜观察的影响

目的 探寻用于观察大鼠耳蜗诱生型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)表达及透射电镜检查最适合的固定液配比,简化实验手段.方法 将正常大鼠6只(12耳,正常组)和庆大霉素耳中毒模型大鼠6只(12耳,模型组)各分为A、B两组(每组各3只,6耳),A组给予2.5％多聚甲醛-2.5％戊二醛、B组给予4％多聚甲醛-0.5％戊二醛混合液心内灌注耳蜗固定处死,然后进行耳蜗免疫组化染色及透射电镜观察,比较两组耳蜗的染色和电镜固定效果.结果 正常组与模型组大鼠的耳蜗外毛细胞、螺旋神经节等均有iNOS阳性表达;但正常组及模型组的A组耳蜗组织免疫组化染色有轻度溶解,背景染色不佳,B组耳蜗组织细胞染色清晰,对比度及透明度好,背景无明显着色.正常组及模型组中A、B两组电镜下耳蜗细胞器等微结构清晰.结论 4％多聚甲醛-0.5％戊二醛混合液心内灌注的方法既能较好地固定大鼠耳蜗细胞器的结构,也能较好的保留iNOS抗原.     

Gene transfer into the mammalian inner ear using HSV-1 and vaccinia virus vectors.

The introduction of foreign genes into cells has become an effective means of achieving intracellular expression of foreign proteins, both for therapeutic purposes and for experimental manipulation. Gene delivery to the nervous system has been extensively studied, primarily using viral vectors. However, to date less work has focused on gene delivery to the inner ear, and existing studies have primarily used adenovirus and adeno-associated virus. Using two recombinant viral vectors, herpes simplex type 1 (HSV-1), and vaccinia virus, bearing the Escherichia coli lacZ gene, we tested gene delivery to the guinea pig cochlea in vivo with beta-galactosidase staining as an assay. The HSV-1 and vaccinia virus vectors were both found to infect and elicit transgene expression successfully in many cells in the guinea pig cochlea, including cells in the organ of Corti. These data demonstrate the feasibility of gene delivery to the inner ear using these two viral vectors. Such techniques may facilitate study of the auditory systems, and might be used to develop gene therapy strategies for some forms of hearing loss.