焦磷酸测序技术检测k-ras基因突变方法的建立

目的:建立k-ras基因突变的焦磷酸测序方法,并分析该基因在结直肠癌中的突变率.方法:制备10份卫生部临床检验中心2013年全国k-ras基因突变检测室间质评模板DNA,对焦磷酸测序技术检测k-ras基因突变方法进行验证;制备230例结直肠癌标本gDNA,应用PyroMark Q24焦磷酸测序仪进行k-ras基因的焦磷酸测序.结果:建立了k-ras基因突变的焦磷酸测序新方法,检测正确率100％;230例结直肠癌标本中共检出基因突变型33例,总突变率14.34％ (33/230),其中12号密码子上34G＞T的突变率为1.74％ (4/230),35G ＞A的突变率为5.22％ (12/230),35G＞T的突变率为3.04％ (7/230),37G＞A的突变率为0.43％ (1/230),13号密码子上38G＞A的突变率为3.91％ (9/230).结论:k-ras基因突变的焦磷酸测序新方法具有快速、准确和高通量的优点,适合于在科研和临床基因扩增检验中推广.     

EGFR基因突变直接测序检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床表皮生长因子受体（EGFR）基因直接测序突变检测方法.方法 以EGFR基因突变热点19、21外显子为突变检测靶位点设计特异性扩增、测序引物,以已知19、21外显子野生型、突变型样品分别做为阴、阳性对照品,建立EGFR基因突变直接测序检测方法,进行方法学评估.结果 成功建立了EGFR基因突变直接测序检测方法,该方法检测灵敏度为4.7 ng/μl,重复性良好.检测30例结非小细胞肺癌样品,突变率为26.7％.结论 本研究建立了可用于临床样品检测的EGFR基因突变直接测序检测方法.     

KRAS基因突变直接测序检测方法的建立

目的 建立一种适用于临床的KRAS基因直接测序突变检测方法.方法 以KRAS基因12、13密码子为突变检测靶位点设计特异性扩增、测序引物,以已知12、13密码子野生型、突变型样品分别做为阴、阳性对照品,建立KRAS基因突变直接测序检测方法,并行方法学评估.结果 成功建立了KRAS基因突变直接测序检测方法,该方法检测灵敏度达3.9 ng/μl,重复性良好.检测17例结直肠癌样品,突变率为23.5％.结论 本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因突变直接测序检测方法.     

CAT基因突变热点区域的PCR扩增方法

目的探讨过氧化氢酶基因突变热点区域PCR扩增方法,提高PCR反应的特异性和灵敏度,有助于快速检测CAT基因相关疾病。方法从人静脉血液标本提取人血液基因组DNA,设计引物扩增特定的CAT基因片段,联合应用热启动PCR和降落PCR技术。结果建立了重复性好,分辨率高的PCR反应体系。结论建立了适用于CAT基因突变热点区域的PCR反应体系,有助于快速检测CAT基因相关疾病。     

DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变的临床应用

目的:探讨DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变的临床应用效果。方法:通过数字表法选择2014年5月—2016年5月初步诊断为结核病患者70例的痰样,使用DNA微陈列芯片法快速检测,并同时通过传统药敏试验和DNA测序法进行再次检查以作为对照。结果:70株结核分枝杆菌中药物敏感株芯片杂交共计20株,这一结果完全符合标准株,符合率100%(20/20),30株耐利福平(RIF)临床分离株均检测到rpoB基因突变,基因突变检出率为100%(30/30),50株异烟肼耐药株中有41株检测katG基因突变,检出率82.00%,9株检测到inhA基因突变,检出率18.00%(9/50),这一检测结果和测序结果完全符合。结论:DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变效果良好,虽然暂且不能代替传统的药敏试验方法,但其检测的灵敏度高,特异性和重复性好。     

人类EGFR基因突变体质控品的建立

目的:构建了29种人类EGFR基因突变体质控品,为人类EGFR基因突变检测试剂盒的性能评价提供了可靠的质控物质。方法:根据人类EGFR全基因序列,应用Primer Premier 5.0软件在选取的序列区域设计引物,通过PCR介导的定点突变技术引入突变位点、PCR产物与克隆载体连接,转化感受态细菌,筛选阳性克隆等,建立了包含不同人类EGFR基因突变体的质控品。结果:对29种人类EGFR基因突变体质控品进行序列测定,并将测序结果进行BLAST比对,结果表明成功建立了人类EGFR基因突变体质控品。结论:本研究建立的EGFR基因突变体质控品涵盖了EGFR基因的29种突变位点,覆盖了目前最常见的EGFR基因突变类型,能够用于评价国内大多数EGFR基因突变检测试剂盒。     

突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织EGFR基因突变

目的：建立突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。方法：选取55例细支气管肺泡癌和59例非小细胞肺癌病理组织蜡块，提取基因组DNA，采用不同的突变体富集PCR法（PCR-PAGE和PCR-RLFP）检测EGFR基因常见的19和21外显予突变，并经过直接测序验证。结果：在59例非小细胞肺癌中共检测出EGFR基因突变22例,突变率为37．3％（22／59）。55例细支气管肺泡癌中共检测出24例基因突变，突变率为43．6％（24／55）。经直接测序验证，EGFR19外显予有3种类型缺失突变。EGFR21外显予的错义突变为L858R。结论：突变体富集PCR法准确、快速、经济，便于临床筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。     

DHPLC法和测序法检测结核分枝杆菌临床分离株链霉素的耐药性

目的我国是WHO认定的结核病高发区域之一。链霉素在我国已经使用50年以上,现在在结核病治疗中仍广泛使用。本工作采用变性高效液相色谱(DHPLC)法和测序法来分析结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL和rrs基因突变,从而检测是否对链霉素耐药。方法215株结核分枝杆菌临床分离株(经常规方法证实,115株为链霉素耐药,100株为敏感),测定链霉素最小抑菌浓度(MIC),同时采用DHPLC和测序法检测rpsL和rrs基因突变。结果85.2%(98/115)的链霉素耐药株携有rpsL或/和rrs基因突变,其中rpsL基因突变占大多数(76.5%,88/115)。对98株带有基因突变的菌株的分析表明,rpsL,rrs基因的突变类型与MIC之间未见密切关系。100株敏感株未检出基因突变。DHPLC法与测序法结果完全一致。结论本工作建立的DHPLC法可以认为是结核分枝杆菌链霉素耐药分析的一种有效的工具。     

血清快速分离板检测儿童碱性磷酸酶方法的建立

目的:研制一种干化学与液体湿化学反应相结合的血清快速分离板装置,建立半定量检测儿童血清碱性磷酸酶(ALP)的新方法,以满足儿童检验的微量化要求。方法:加工尼龙网膜、吸附层膜、转运膜、反应膜、底板、上盖和上小盖,组装成血清快速分离板;制备样品稀释液、自行合成色原基质液和显色液;用准确定量的ALP活性分别为200、250和300U/L的参照血清于分离板上检测,以反应膜所呈现的不同颜色印制对照色板。结果:制成血清快速分离板装置,建立血清半定量检测ALP方法,结果显示准确性、重复性良好,显色稳定,显色变化与ALP活性改变一致。结论:该方法利用国产原材料设计了一种血清快速分离装置,操作简便、试剂稳定、结果易于判读且成本低廉,有利于儿童佝偻病或钙缺乏的诊断和治疗。     

利用多重荧光定量PCR检测阿胶原料驴、马、驴骡和马骡皮张的源性

目的 建立快速检测阿胶原料皮张源性的方法.方法 根据马、驴、驴骡和马骡的核基因肌酸激酶CKM和线粒体基因组DNA(mtDNA)的16S rRNA基因序列设计特异,并引入18S rDNA作为内参质控,建立能检测4种动物源性的5重多色荧光定量PCR检测体系.结果 本研究开发的引物和分子信标探针的特异性强,能同时区分同源性相近的驴、马、驴骡和马骡源性;灵敏度高,检测限为0.01 ng·μL-1.通过对某阿胶制品公司收购的驴皮源性检测,检测结果与DNA测序一致率达100％.结论 本方法在一管PCR反应中能同时检测4种动物源性,更简单、准确和高效,为驴皮、马皮及骡子皮张的源性鉴定探索了新的途径.     

Pyrosequencing检测CYP2C9^＊3基因多态性方法的建立及其可靠性研究

目的：建立基于焦磷酸测序技术（Pymsequencing）的高通量的CYP2C9^＊3突变检测方法。方法：应用带有生物素标记的扩增引物,经PCR扩增及Beads分离,制备该突变位点焦磷酸测序单链模板,并在PyroMark ID焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序,以经典ABI测序法测序结果作为标准对照,观察批量分析的可靠性并批量检测220例人DNA标本。结果：建立了基于焦磷酸测序技术的CYP2C9^＊3突变位点检测平台,实现了DNA标本的高通量检测。能一次获得96份DNA的CYP2C9^＊3突变位点检测结果。经重复性检测和标准的ABI测序可靠性检测,CYP2C9^＊3突变位点的突变检出率及重复率均达100％。结论：本方法可准确、高通量、快速检测CYP2C9^＊3突变,特别适宜该SNP位点批量检测需要。     

A comparison of pyrosequencing and neuraminidase inhibition assays for the detection of oseltamivir-resistant pandemic influenza A(H1N1) 2009 viruses

Currently most pandemic influenza A(H1N1) 2009 (H1N1pdm) viruses are sensitive to oseltamivir, but a single point mutation (H275Y) in the neuraminidase (NA) gene of H1N1pdm can lead to resistance and such viruses have been reported from several countries. In this study we compare the performance of a pyrosequencing-based method for the detection of the H275Y mutation in H1N1pdm viruses with a conventional NA inhibition assay. Pyrosequencing could detect as little as 5% H275Y mutants in a mixed viral population, while mixtures with 25% or greater mutant virus were required before a significant increase in IC50 value could be detected. However, the sensitivity of the NA inhibition assay could be enhanced by using a more sophisticated curve-fitting analysis to generate similar results to the pyrosequencing assay. Of 181 H1N1pdm clinical samples examined by pyrosequencing, nine samples from five patients were found to contain H275Y mutant viruses, four of whom were under oseltamivir treatment. Changes in the ratio of H275Y mutant to wild-type viruses were observed in serial clinical specimens from two patients over the duration of their treatment. This study highlights the need for close monitoring of the H275Y mutation in clinical samples, in particular from severely ill patients infected with H1N1pdm. The use of pyrosequencing and the NA inhibition assay provide powerful tools for the rapid detection and quantitation of resistant influenza viruses in mixed populations.     

应用PCR和单克隆抗体方法从人粪便及肿瘤组织中检测大肠癌基因突变的研究

目的：检测大肠癌病人粪便中脱落细胞与肿瘤组织细胞的DNA，对比两者K—ras基因序列和突变位点的变化，为临床非介入性的、简便的大肠癌诊断提供理论和实验依据。方法：分离和提纯大肠癌组织及粪便中脱落细胞的DNA，用PCR(Polymerase chain reaction)法扩增K—ras基因，克隆K-ras基因PCR产物并进行DNA序列的测定。免疫组化检测大肠癌相应抗原的表达：采用ELISA法，用大肠癌单克隆抗体对大便样品进行检测。结果：同一病人的大肠癌组织细胞与粪便中的脱落细胞的K—ras基因的序列完全一致，并检测到1例K—ras基因点突变。K-ras基因突变与否与大肠癌病理类型和大肠癌单克隆抗体检测大便样品中脱落细胞的癌抗原表达水平有一定的相关性。结论：以大肠癌分子发病机理为基础的非介入性检测粪便中K-ras突变是可行的，有望成为正常人群大肠癌筛查以及诊断的新方法之一，可以为大肠癌的早期发现及监测大肠癌的发生、发展和预后提供理论和实验依据。     

Genotyping of thiopurine methyltransferase using pyrosequencing

Thiopurine methyltransferase (TPMT) metabolizes thiopurine drugs which are used in the treatment of leukemia and some autoimmune diseases. Previously, 11 mutant alleles of TPMT gene (TPMT*1S, *2, *3A, *3B, *3C, *3D, *4, *5, *6, *7, and *8) have been reported. These mutant alleles may cause life-threatening toxicity in patients exposed to thiopurine drugs, 6-mercaptopurine and azathioprine. We have developed a rapid and accurate protocol for TPMT genotype determination using Pyrosequencing(TM) technology in 96 Japanese subjects. Five fragments of the TPMT gene (exon 4, 5, 7, 8, 10) were amplified by PCR, and the 10 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) for TPMT*1S, *2, *3A, *3B, *3C, *3D, *4, *5, *6, *7, and *8 were sequenced. The results of this pyrosequencing method corresponded exactly with those of the DNA sequencing method using BigDye terminator chemistry. We have demonstrated that typing of 10 SNPs can be performed within 30 min. Pyrosequencing has a wide application in the large-scale identification of individual TPMT genotypes.     

Detection of gyrA mutations associated with ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae by rapid and reliable pre-programmed short DNA sequencing

Quinolone resistance is rapidly increasing in Neisseria gonorrhoeae and is posing a significant public health threat that requires constant surveillance. A rapid and reliable mutation detection assay has been developed. The assay is based on pre-programmed short DNA sequencing and is designed to detect point mutations in the gyrA gene that are highly related to ciprofloxacin resistance, i.e. in codons 91 and 95. By developing an assay based on pyrosequencing and exploiting the pre-programmed nucleotide dispensation capability of this technology, the sequence comprising the mutations will be analysed and promptly reveal whether the N. gonorrhoeae pathogen carries resistance to ciprofloxacin. A panel of 40 N. gonorrhoeae clinical isolates, of which 27 phenotypically displayed decreased susceptibility or resistance to ciprofloxacin, was used in the present study. All point mutations in the short stretch of the N. gonorrhoeae gyrA gene were easily discriminated, and the genotypic results obtained by pre-programmed sequencing were mainly in agreement with the phenotypically identified decreased susceptibility or resistance to ciprofloxacin. The new method used in the present study has the potential for rapid and reliable identification of known as well as previously unknown drug resistance mutations.     

微孔板固相杂交法检测乙型肝炎病毒YMDD变异

目的:建立一种快速、准确、简便的检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的方法。方法:对132份HBVDNA阳性血清标本进行基因测序检测,选取有YMDD变异和无YMDD变异血清标本各20份进行巢式聚合酶链反应,并采用微孔板固相杂交法检测,结果判定阴性和阳性,设直接测序方法为对照进行比较。结果:微孔板固相杂交法检测结果显示,入选的40份标本中19份有变异,21份无变异,其灵敏度为94.74%,特异度为90.48%。结论:微孔板固相杂交法检测乙型肝炎病毒快速、准确、简便,并且可同时检测野生株和变异株类型,尤其适用于大批量标本的检测,便于基层推广。     

核苷类药与慢性HBV感染者病毒P基因准种及变异特点的关系

目的观察核苷类药治疗不同时间段慢性HBV感染患者血清乙肝病毒聚合酶(HBV P)基因准种变化及变异特点。方法运用焦磷酸测序仪器配套的软件Assay Design SW在目的区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物,采用套式PCR方法检测血清中HBV DNA,按照Pyro-Mark ID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物(HBV P基因相关位点)的焦磷酸测序和突变频率检测。108例慢性HBV感染患者中用药史明确者同期测定HBV DNA、HBV标志物、ALT。结果108例患者中,61例发生变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,有少量V173L、S202G、T184G突变;其中40例用药史明确患者中,18例发生变异,发生变异者耐药突变型在样本中所占比例为20%-100%,HBV P基因变异可以在HBV DNA、ALT发生突变前、中、后检出。结论焦磷酸测序可以快速检测HBV P基因变异;变异株突变频率变化可初步反映HBVP基因准种异质性;HBV P基因变异模式、突变频率与核苷类药物敏感性密切相关。     

GLI3基因新发突变致多指（趾）畸形一家系

目的 对1个先天性多指（趾）畸形家系进行GLI家族锌指3基因（GLI3）突变分析,进一步丰富GLI3的突变谱。方法 收集1例临床诊断为多指（趾）畸形的患儿资料,提取患儿外周血DNA,应用全外显子测序方法检测与患儿症状相关的致病基因,并在家系其他成员中应用Sanger测序进行验证。结果 该家系中包括患儿在内的4位多指（趾）畸形患者位于7p14.1的GLI3基因存在c.2783delG（p.Arg928Profs24X）框移突变。在该家系的正常成员中未检测到该位点突变。经查询HGMD、Clinvar及dbSNP数据库均未见相关报道。该病例多指（趾）畸形诊断明确,其突变位 点为新突变。GLI3基因的c.2783delG（p.Arg928Profs24X）框移突变可能为该家系的发病原因。结论 本研究发现新发突变 GLI3［c.2783delG（p.Arg928Profs24X）］,进一步丰富了 GLI3基因的突变谱,为深入研究多指（趾）畸形的发病机制提供了新的内容。     

乙型肝炎病毒YMDD变异株的检测及临床意义

目的：建立乙型肝炎病毒P区基因直接测序方法，进一步了解口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者HBVP区发生YMDD变异的情况，并探讨其相关影响因素。方法：应用聚合酶链反应（PCR）扩增HBVDNAP基因区，通过直接测序方法与Genebank标准序列对比，对107例慢性乙肝（CHB）患者血清进行P区测序。结果：107例慢性乙肝患者YMDD变异率为32．7％，其中YIDD变异17例，YVDD变异15例，混合变异3例。YMDD未变异组治疗前谷丙转氨酶（ALT）水平显著高于变异者；而YMDD变异组治疗前HBVDNA含量显著高于未变异组；YMDD未变异组与变异组之间治疗前的患者性别、年龄和HBeAg状态等方面差异无统计学意义。结论：HBVYMDD变异可能与患者治疗前ALT水平和HBVDNA含量有一定关系．而与患者的性别、年龄和血清HBeAg状态无关。