四氯化碳损伤小鼠肝脏基因表达谱的变化四氯化碳损伤小鼠肝脏基因表达谱的变化

目的研究CCl₄肝损伤小鼠肝脏的基因表达谱，筛选与CCl₄肝损伤相关的基因网络，探讨其肝损伤机制。方法提取小鼠的肝组织总RNA，经反转录分别用Cy3和Cy5荧光标记，制备用于芯片杂交的cDNA探针；cDNA探针与联合基因公司BioStarM-141S小鼠基因表达谱芯片进行杂交，结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果 在CCl₄肝损伤小鼠的基因表达谱中，有379条基因发生了差异性表达(2.69％)。其中，163条基因表达量明显上调，另外216条基因表达量明显下调。结论CCl₄引起小鼠肝脏基因表达谱变化，利用小鼠基因表达谱芯片能大规模、高通量筛选与CCl₄肝损伤相关基因，对进一步阐明CCl₄及类似的化学肝毒物对肝脏的损伤机制有十分重要的意义。     

定量PCR法和DNA杂交法检测聚乙二醇修饰尿酸酶原液中DNA残留量的比较

目的 建立快速准确的聚乙二醇修饰重组尿酸酶(PEGylated uricase，PEG-UHC)原液DNA残留量测定法，为其他多位点PEG修饰蛋白药物的DNA残留量检测提供参考。方法 参照中国药典2020年版三部“外源性DNA残留量检测法”第一法DNA探针杂交法和第三法定量PCR法，检测PEG-UHC原液DNA残留量；对定量PCR法进行检测限度、线性范围、准确度和精密度等方法学验证；进行3批次PEG-UHC原液DNA残留量测定。结果 探针杂交法DNA残留量测定线性范围为1×10^-4~0.1 ng·μL^-1，3批次PEG-UHC原液未见明显显色，DNA残留量均低于每剂10 ng。PCR法检测限度为1×10^-5 ng·μL^-1，DNA浓度在1×10^-4~100 ng·μL^-1内线性关系良好(R²=0.999)。不同浓度的标准DNA在PEG-UHC原液中的回收率范围为92.57%~114.17%，表明PEG偶联物对定量PCR影响较小。3批次PEG-UHC原液中DNA残留量分别为每剂0.143，0.187，0.154 ng，符合国家药品监督管理局限量要求。结论 DNA探针杂交法为传统定性检测，耗时较长，准确度较低。定量PCR法操作简便快速、灵敏度高，且可定量分析，适于PEG-UHC等多位点PEG修饰蛋白药物DNA残留量测定。     

西红花苷对牛主动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响

目的研究西红花苷对血管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响。方法以Fluo-3/AM作为Ca²⁺荧光探针,采用激光扫描共聚焦显微镜观察牛主动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的变化。结果无论细胞外有无钙离子,西红花苷(1×10^-8,1×10^-7,1×10^-6 mol·L^-1)均能明显抑制1×10^-2 mol·L^-1 H₂O₂引起的细胞内钙离子浓度的升高,其抑制率含钙条件下分别为34.1%, 57.1%和74.3%(P<0.01),无钙条件下分别为26.2%,32.1%和50.0%(P<0.01);在胞外无钙的条件下,西红花苷 (1×10^-8,1×10^-7,1×10^-6 mol·L^-1)能抑制70 mmol·L^-1 CHCl₃导致雷洛丁敏感钙池的释放,其抑制率分别为27.8%, 27.8%和50.0% (P<0.01)。结论西红花苷能抑制胞外钙离子的内流及内质网上钙离子的释放。     

荧光光谱法研究抗癌新药吡柔比星与DNA的相互作用

目的：研究抗癌新药吡柔比星(THP)与DNA的作用方式。方法：利用荧光光谱法和吸收光谱法,以THP为荧光探针研究测定DNA。结果：THP与DNA的结合常数为1.66×105 L.mol^-1,结合位点数为2.6 base pairs。此外,利用DNA对THP的荧光猝灭作用研究了对DNA的分析应用。DNA的检出限为0.91 μg.mL^-1,线性范围为0.91～9.0 μg.mL^-1和9.0 μg.mL^-1～26 μg.mL^-1。结论：THP的蒽醌环与DNA的碱基对发生嵌入作用,而THP的含糖侧链与DNA有小沟槽作用。     

巴罗沙星与DNA的相互作用及Mg2+的影响

目的研究巴罗沙星与DNA的分子作用机制和Mg²⁺对巴罗沙星与DNA相互作用的影响。方法利用荧光光谱研究巴罗沙星与DNA的作用强度并计算热力学数据ΔH；利用紫外光谱、黏度测定、竞争实验、与变性DNA作用的比较等方法确定巴罗沙星与小牛胸腺DNA的相互作用方式；利用荧光光谱考察Mg²⁺对巴罗沙星与小牛胸腺DNA相互作用的影响。结果DNA对巴罗沙星的荧光猝灭常数为(5.43±0.07)×10³ L·mol^-1，ΔH=-8.03 kJ·mol^-1；Mg²⁺使巴罗沙星与DNA的作用增强。结论巴罗沙星以沟槽键合方式与DNA相互作用；Mg²⁺对巴罗沙星与DNA的结合有中介作用。     

双环醇对刀豆蛋白A引起肝损伤小鼠肝脏基因表达谱的影响

本实验研究双环醇对刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)静脉注射引起免疫性肝损伤小鼠肝脏基因表达谱变化的影响，探讨双环醇肝保护作用的分子机制。小鼠于注射Con A 26.5 mg·kg^-1前24、 8及1 h分别口服双环醇250 mg·kg^-1。测定血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，提取小鼠肝脏总RNA，经反转录用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分别标记制备cDNA探针。将cDNA探针与BiostarM-40S小鼠基因表达谱芯片进行杂交，经ScanArray 4000扫描仪扫描芯片并用GenePix Pro 3.0软件进行分析。双环醇可显著抑制刀豆蛋白A引起的血清ALT和AST升高。与刀豆蛋白A对照组相比，双环醇给药组有287条基因发生差异表达，占芯片基因总数的7.00%。其中166条基因表达量明显下调，121条基因表达量明显上调。表达变化的基因主要涉及代谢与细胞色素P450、应激与炎症凋亡、细胞周期调控、信号传导以及再生等相关功能。双环醇对刀豆蛋白A引起小鼠肝损伤肝脏基因表达谱变化具有一定的影响，此结果对今后深入研究双环醇的肝脏保护作用特点和临床应用具有重要意义。     

水飞蓟素微乳大鼠在体小肠吸收的动力学

目的考察水飞蓟素微乳的形态学和粒径分布，研究水飞蓟素微乳在小肠各部位的吸收情况，并与水飞蓟素胶束在空肠的吸收进行比较。方法采用大鼠在体小肠段回流实验，紫外分光光度法测定药物浓度，依据药物在小肠段中的减少量来确定药物的吸收。结果透射电镜下水飞蓟素微乳成球形或近球形，大小均匀，平均粒径约为20 nm。在整个小肠、回肠、空肠、十二指肠以及结肠中的吸收速率常数依次是6.22×10^-2,2.27×10^-2,1.9×10^-2,1.05×10^-2,0.43×10^-2 h^-1，两种水飞蓟素胶束在空肠的吸收速率常数分别是0.36×10^-2,0.65×10^-2 h^-1。结论水飞蓟素微乳在小肠下段吸收较好，吸收呈一级动力学过程，吸收机制为被动扩散。     

心血管相关基因芯片的制备及其在知母皂苷作用机理研究中的应用心血管相关基因芯片的制备及其在知母皂苷作用机理研究中的应用

目的研究知母皂苷活血化瘀作用的分子机制。方法制备了包含87个心血管疾病相关基因探针的寡核苷酸芯片。将80 mg·L^-1 知母皂苷作用8 h及未作用的培养人血管内皮细胞提取总RNA，通过逆转录分别标记Cy 5和Cy 3荧光染料，然后与芯片杂交，检测知母皂苷对血管内皮细胞中心血管疾病相关基因表达的影响。结果知母皂苷作用于血管内皮细胞后，血管紧张素酶原（AGT）基因、肾上腺素α2A受体（ADRA2R）基因和内皮素转换酶-1（ECE-1）基因的表达均有不同程度的下调。结论知母皂苷有调控血管内皮细胞功能的作用，可能是其治疗心血管疾病的机制之一。     

四苯硼钠滴定液浓度测量的不确定度评定

目的 对按中国药典2010年版第一增补本方法配制和标定的四苯硼钠滴定液(0.02 mol·L^-1)浓度进行不确定度评定。方法 通过对不确定度来源分析,建立测量模型,对标定过程中各不确定度的分量进行分析评估。结果 通过计算各变量的不确定度分量,得到本次标定浓度的相对标准不确定度为4.46×10^-3,合成标准不确定度为8.9×10^-5 mol·L^-1,扩展不确定度U=0.000 18 mol·L^-1,k=2。结论 建立了四苯硼钠滴定液浓度的测量不确定度评定方法,通过分析评估各分量不确定度的大小而明确测量不确定度的主要因素,优化实验条件使测定结果更加可靠准确。     

聚合物囊泡的稳定性及H+透膜特性考察

目的 以嵌段聚合物制备聚合物囊泡并考察其稳定性，测定聚合物囊泡膜层的H⁺跨膜渗透特性，及1,4-二氧六环对膜渗透性能的影响，作为聚合物囊泡载药的基础。方法 以二嵌段共聚物PEG-PLGA在溶液中自组装制备聚合物囊泡，采用pH敏感荧光探针HPTS对囊泡的H⁺透膜特性进行考察，并与PBD-b-PEO、PS-b-PEO制备的囊泡及脂质体进行比较。考察不同浓度的1,4-二氧六环对聚合物囊泡膜渗透特性的作用。结果 HPTS的荧光激发光谱有pH依赖性，囊泡外水相中H⁺浓度与t^1/2呈线性相关，不同膜壁厚度的聚合物囊泡的膜渗透能力有显著区别。3种聚合物囊泡对比脂质体，H⁺透膜系数分别降低了2.39×10⁴ 、3.38×10⁴、5.48×10⁸倍。1,4-二氧六环对囊泡膜的渗透性具有调节作用，且存在浓度依赖关系。结论 聚合物囊泡的膜渗透显著低于脂质体，稳定性更好，1,4-二氧六环可调节囊泡膜的渗透性，从而调节药物的装载和释放。     

对斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量的影响因素研究

目的:对斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中的6个影响因素进行评价。方法:对不同的样品稀释液,样品中是否含有蛋白,含蛋白样品是否采用蛋白酶K处理,采用不同方法预处理的模板DNA作为标记用模板,采用不同体积的离心管进行探针标记,分别采用不同的杂交温度,共计6个因素对检测结果的影响进行评价。结果:在使用随机标记的探针通过斑点杂交方法检测重组生物制品中残留宿主细胞DNA含量试验中:标准品和样品稀释中使用水进行稀释时结果可信度较高;样品中含有蛋白会降低检测的灵敏度;在含蛋白样品中加入蛋白酶K处理可以在一定程度上提高检测的灵敏度;使用超声处理的模板DNA作为探针标记的模板时,检测灵敏度较高,同时背景较低;探针标记过程中应采用0.2 mL薄壁PCR管作为容器以保证试验成功率;最适的杂交温度为42℃左右。结论:在斑点杂交方法检测治疗性单克隆抗体制品中残留宿主细胞DNA含量中,采用水作为稀释液,对含蛋白样品使用蛋白酶K消化,标记用模板DNA使用超声处理,使用0.2 mL薄壁PCR管作为标记反应管和在42℃杂交时,结果的稳定性和灵敏度有较大提高。     

血液微渗析技术研究酮洛芬在大鼠体内的药代动力学

目的考察酮洛芬微渗析体内外回收率及影响因素，研究酮洛芬静脉给药后非结合型药物在大鼠体内的药代动力学。方法大鼠颈静脉插入探针后，依次用不同浓度的灌注液对探针进行灌注，测定酮洛芬体内回收率及非结合型酮洛芬在大鼠体内的药代动力学。以高效液相色谱法测定微渗析液中药物浓度。体外回收率的测定采用浓差法。结果增量法及减量法测定的回收率一致。以浓差法测定的体外回收率为28.75%；反渗析法测定体内回收率为(40.3±2.7)%。酮洛芬静脉给药后非结合型药物的T_1/2，AUC和CL分别为(181±16) min，(112±27) μg·min·mL^-1和(0.22±0.05) min^-1。结论血液微渗析技术可用于研究非结合型酮洛芬在大鼠体内的药代动力学。     

四环素及β-内酰胺耐药性基因芯片的制作及优化

目的 优化四环素及β-内酰胺耐药性基因芯片制作和杂交条件.方法 设置多组实验,逐一改变影响寡核苷酸在玻片表面固定及芯片杂交效率的实验条件,从中优化出芯片实验的最佳条件.结果 得出的最佳条件是:探针以30 pmol/μL的终浓度溶于50%二甲基亚砜中,在温度为20℃、湿度70%的条件下点制在基片上;荧光探针纯化后使用2×杂交液在42℃湿盒中杂交5 h.结论 优化出了耐药基冈芯片制作和杂交的最佳条件,总结出芯片制作优化的方法.     

Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging

Recent advances in the development of nanotechnology and devices now make it possible to accurately deliver drugs or genes to the lung. Magnetic nanoparticles can be used as contrast agents, thermal therapy for cancer, and be made to concentrate to target sites through an external magnetic field. However, these advantages may also become problematic when taking into account safety and toxicological factors. This study demonstrated the pulmonary toxicity and kinetic profile of anti-biofouling polymer coated, Cy5.5-conjugated thermally cross-linked superparamagnetic iron oxide nanoparticles (TCL-SPION) by optical imaging. Negatively charged, 36 nm-sized, Cy5.5-conjugated TCL-SPION was prepared for optical imaging probe. Cy5.5-conjugated TCL-SPION was intratracheally instilled into the lung by a non-surgical method. Cy5.5-conjugated TCL-SPION slightly induced pulmonary inflammation. The instilled nanoparticles were distributed mainly in the lung and excreted in the urine via glomerular filtration. Urinary excretion was peaked at 3 h after instillation. No toxicity was found under the concentration of 1.8 mg/kg and the half-lives of nanoparticles in the lung and urine were estimated to be about 14.4 ± 0.54 h and 24.7 ± 1.02 h, respectively. Although further studies are required, our results showed that Cy5.5-conjugated TCL-SPION can be a good candidate for use in pulmonary delivery vehicles and diagnostic probes.     

检测流感疫苗中宿主细胞DNA残留量的地高辛标记探针杂交法的建立

目的  建立地高辛标记DNA探针杂交法,检测基于Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞生产的流感疫苗中宿主DNA的残留量。方法  提取MDCK细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针。对地高辛标记DNA探针杂交法进行特异性、灵敏度及稳定性验证, 并用此法检测3批MDCK细胞流感疫苗中的DNA残留量。结果 MDCK细胞基因组DNA的质量浓度为33 ng/μl,260 nm与280 nm波长处的吸光度比值为1.9。制备的探针与非同源细胞DNA无杂交,最低检测限度为10 pg。探针在－70 ℃放置9个月后,检测灵敏度仍可达到10 pg。经检测,MDCK细胞流感疫苗成品中的DNA残留量＜10 ng。结论  建立的地高辛标记探针杂交法特异性强、灵敏度高、稳定好,并且操作简便,可用于MDCK细胞流感疫苗中DNA残留量的检测。     

三维凝胶NAT2基因分型芯片的制备与优化

目的研制N-乙酰化酶2(NAT2)基因分型芯片,以快速、准确检测患者的NAT2单核苷酸基因多态性。方法设计并合成中国人中常见的NAT2酶基因5个突变位点的探针对和包含5个突变位点的两对引物;样本经PCR扩增后,采用丙烯酰胺点样液制备芯片,并与TEMED反应固化芯片;分别用探针与芯片杂交,采用博奥晶芯LUXSCAN10K微阵列芯片扫描仪分析结果。结果优化了PCR扩增条件,使两组PCR在相同条件下扩增;优化了芯片制备及杂交条件,双链DNA采用碱变性,清除非特异键合采用电泳方法;建立了NAT2酶基因分型标准:信号强度Cy3∶Cy5≥5为野生型,Cy3∶Cy5为0.6~1.5时为杂合子,Cy3∶Cy5≤0.2为突变型;对20例标本的基因分型结果采用直接测序法进行验证,结果均一致。结论三维凝胶NAT2基因点突变分型芯片法是一种特异性强、高通量的NAT2基因分型方法,适用于临床快速基因分型,指导相关药物合理使用。     

地高辛标记探针检测重组人p43蛋白宿主DNA残留量的研究

目的:建立重组人p43蛋白原液中宿主DNA残留量的检测方法。方法:以重组人p43工程菌基因组DNA为模板,制备地高辛标记的探针,并以此探针与阳性对照品及供试品进行杂交及显色反应。结果:3批次重组人p43蛋白原液中每人份剂量的宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:该方法灵敏度高,特异性强,重复性好,操作安全简便,可用于重组人p43制备过程中的原液检定及质量监控。     

EB探针研究吩噻嗪类药物与DNA的作用

目的：用光谱探针溴乙锭(EB)研究3种吩噻嗪药物与DNA的作用。 方法与结果：在pH 7.4的溶液中电子吸收光谱与荧光光谱表明, 同为精神分裂症治疗药的盐酸氯丙嗪(CPZ)和盐酸三氟拉嗪(TFP)与DNA间存在嵌插作用; 有相同功能团的抗组胺药物盐酸异丙嗪(PMZ)与DNA之间为弱的混合作用。 结论：一定的离子强度下该嵌插作用会被阻断。     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗宿主细胞DNA残留量检测方法研究

目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针.比较样品不同处理方式的检测差异.对建立的残留DNA检测方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证.结果 Vero细胞基因组DNA的质量浓度为295 μg/ml,260nm与280nm波长处的吸光度比值为1.88.探针灵敏度达到0.01 pg/μl.采用苯酚抽提方式处理DNA参考品,检测灵敏度为1 ng;而用碘化钠处理DNA参考品,灵敏度达到10 pg.特异性检测表明,探针与非同源DNA无杂交.灵敏度和稳定性检测结果显示,探针于-70℃保存9个月,灵敏度仍为10 pg.结论 建立了Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留量的检测方法.采用碘化钠提取DNA,回收率高,操作简单,适用于Vero细胞的残留DNA检测.