PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

套式PCR扩增特定SSUrDNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的：用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrDNA）基因为靶基因,选用1对疟原属特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果：从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp,102bp和115bp预测大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％,并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.F.和P.m.的混合感染病例,结论本系统特异、灵敏,稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断,大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

聚合酶链反应检测间日疟原虫的现场应用研究

为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）的现场应用价值。根据Ｐ．ｖ．红内期ＳＳｕｒＲＮＡ基因序列合成１对寡核苷酸引物建立检测Ｐ．ｖ．的ＰＣＲ技术，扩增产物片段为３４１ｂｐ，同时采用ＰＣＲ法和镜检法对８份临床疑为Ｐ．ｖ．感染患者的血液标本进行检测。用ＰＣＲ法检测阳性者６９份，镜检法检测阳性者５９份，ＰＣＲ检出率（８８．５％）明显高于镜检法检出率（７５．６％），两者符合率为８７．２％。结     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。     

套式PCR法检测间日疟原虫的研究

以滤纸采集间日疟原虫患者血样，煮沸法萃取ＤＮＡ模板，用间日疟原虫ＳＳＵｒＤＮＡ特异序列为内外引物，进行双温度点套式ＰＣＲ扩增，其检测原虫率水平为０．８４×１０＾－６，特异性强。检测云南疟区发热患者血样１６６份，检出率为６３．９％，显著高于镜检法的４８．２％。以镜检法为参照，本法的敏感性为９７％，特异性为６１％，阳性预期值和阴性预期值分别为６５％和９７％，表明是检测间日疟原虫感染的一个良好手段，可作     

疟疾复合PCR检测系统的建立

目的：建立简易、快速的复合ＰＣＲ系统,用于检测间日疟、恶性疟及混合感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计疟原虫属特异性上游引物Ｓ１和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物Ｓ２和Ｓ３,建立双温度点复合ＰＣＲ扩增系统并用于临床血样的检测。结果：从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出７０５ｂｐ和５７５ｂｐ特定扩增带,而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及健康人血样均未见扩增带。检测原虫水平达２－１０虫／μｌ全血。限制性内切酶酶切分析证实扩增产物为目的片段。检测１０４份镜检确诊疟疾患者血样,其中８１份与镜检结果相符,并查出镜检未发现的１７份混合感染和２份虫种鉴别失误的恶性疟。结论：本系统敏感性高,特异性强,操作简便,可在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。     

套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究

根据间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳｒＲＮＡ）基因序列，设计并合成两对特异引物，采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出一条长１２０个碱基对（ｂｐ）的间日疟原虫ＳＳｒＲＮＡ基因特定片段，并用于云南间日疟患者的血样检测。结果表明：该系统特异性强，除间日疟原虫外，恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）、三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）及正常人血ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。该系统检测原虫的敏感度为０．１个疟原虫／ｌμｌ血，大大高于常规镜检。在进行间日疟检测中，该系统与镜检的阳性符合率为１００％，更重要的是发现镜检漏诊的４例Ｐ．ｖ．和Ｐ．ｆ．的混合感染病例。鉴于该系统具有特异、敏感、稳定、简便的特点和鉴别疟原虫种类、判定混合感染等优点，故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控具有应用价值     

聚合酶链反应检测间日疟原虫的现场应用研究

为探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）的现场应用价值。根据Ｐ．ｖ．红内期ＳＳｕｒＲＮＡ基因序列合成１对寡核苷酸引物建立检测Ｐ．ｖ．的ＰＣＲ技术，扩增产物片段为３４１ｂｐ，同时采用ＰＣＲ法和镜检法对７８份临床疑为Ｐ．ｖ．感染患者的血液标本进行检测。用ＰＣＲ法检测阳性者６９份，镜检法检测阳性者５９份，ＰＣＲ检出率（８８．５％）明显高于镜检法检出率（７５．６％），两者符合率为８７．２％。结果表明ＰＣＲ检测Ｐ．ｖ．具有简便、快速、特异性强、敏感性高等优点，可作为Ｐ．ｖ．诊断和流行病学调查的重要手段     

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

用聚合酶链反应技术检测间日疟原虫感染的研究

用 ５ 种不同的 Ｐ．ｖ．引物分别对间日疟原虫 Ｄ Ｎ Ａ 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,在比较和分析各引物 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的敏感性和特异性的基础上,筛选出一对根据间日疟原虫线粒体细胞色素 Ｃ氧化酶基因序列设计的引物为最佳引物,其检测敏感度可达到每μｌ血中 ０．２４ 个疟原虫。同时还对血样本处理方法进行了改进,从而建立了一种更为简捷、快速、经济且适用于现场应用的间日疟原虫 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法。并利用该方法对２３８ 例门诊发热病人滤纸干血滴样本进行检测,与传统镜检法进行了比较。结果显示, Ｐ Ｃ Ｒ 方法对间日疟的误诊率（０）和漏诊率（１．７％ ）明显比镜检的误诊率（４．２％ ）和漏诊率（４．２％ ）低,具有比常规镜检法更敏感、特异的优点。     

复式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫的研究

目的： 建立在同一次扩增中即可鉴别患者感染的疟原虫虫种的复式ＰＣＲ检测方法。方法： 根据恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）中度重复基因序列ｐＢＲＫ１－１４ 和间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）线粒体细胞色素Ｃ氧化酶基因ＣＯＩＩＩ合成引物,采用经优化的ＰＣＲ反应体系, 对疟原虫ＤＮＡ模板进行扩增。结果： Ｐ．ｆ．与Ｐ．ｖ．分别被扩增出２０６ 和３７０ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,与人白细胞ＤＮＡ 无交叉;用该反应体系至少可检测出原虫血症为５×１０－ ７的Ｐ．ｆ．感染和１．０２×１０－ ６ Ｐ．ｖ．感染; 自云南疟疾流行区采集的７８３份滤纸干血滴样本中, 复式ＰＣＲ法阳性检出率为８５．８％ , 误诊率为０, 漏诊率为０．１％ , 而镜检法依次分别为８４．９％ 、３．１％ 和１．０％ , 两者符合率为９５．８％ 。结论： 本复式ＰＣＲ检测疟原虫较镜检敏感、特异, 适用于我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断、流行病学调查、药物的疗效考核和献血员的筛选等。     

套式聚合酶链式反应诊断恶性疟原虫及混合感染的研究

为了建立一种特异、敏感、简便的疟疾诊断方法,设计并合成两对针对恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳＵｒＲＮＡ）基因特异的引物,采用套式聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术,扩增恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因特定片段。利用该系统诊断云南及海南疟疾患者血样,并随机选取扩增产物进行克隆测序鉴定。结果显示,恶性疟原虫模板均扩增出长度为２０５ｂｐ的特定基因片段,经Ｔ－载体克隆测序与恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ特定基因片段序列完全符合。该系统特异性强,除恶性疟原虫外,间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）、卵形疟原虫（Ｐ．ｏ．）、正常人血ＤＮＡ样本及空白对照均无此扩增带出现。该系统检测原虫的敏感度为１．５个原虫／μｌ,大大高于常规镜检。６１份Ｐ．ｆ．镜检阳性标本在进行ＰＣＲ检测时亦均呈阳性,同时联合应用套式ＰＣＲ扩增间日疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ特定基因片段的检测系统,发现６１例恶性疟病人中２３例是Ｐ．ｆ．和Ｐ．ｖ．混合感染。该检测系统具有特异、敏感、稳定、简便的特点,对疟疾的诊断、混合感染的判定具有一定的临床应用价值     

单克隆抗体－ELISA技术检测间日疟感染的现场研究

对１１２例发热病人血样同时进行镜检和用ＭｃＡｂ－ＭｃＡｂＥＬＩＳＡ夹心法检测间日疟抗原，发热病人血片分别由基层镜检员和省级专业人员镜检，检出间日疟阳性率分别为３０．３６％和４３．７５％，ＥＬＩＳＡ法检测阳性率为４２．８６％，其敏感性、特异性均在９５％以上。具有采样方便、样本可成批操作、结果客观等特点，适用于基层开展灭疟后期疟疾传染源监测。     

用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的　阐明 Fcc1/ HN株与云南株间的不同生物学特性。　方法　用 M2 6 - 32 作探针 ,筛选恶性疟原虫 c DNA基因表达文库 ,根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物 ,分别进行 PCR扩增 ;地高辛酶促生物标记 Fcc1- HN株 DNA的 PCR扩增产物 ,分别与 Fcc1/ HN株 DNA、云南株 DNA和阳性克隆 5 11的扩增产物杂交。　结果　 PCR扩增后 Fcc1/ HN株 DNA在约 5 0 0 bp和 4 5 0 bp处有 2条特异性条带 ;云南株 DNA在约 5 0 0 bp处有 1条较淡的条带和 130 0bp处一较亮的特异性条带 ;阳性克隆 5 11仅在约 5 0 0 bp处有 1条特异性条带。标记探针能与克隆 DNA、恶性疟原虫Fcc1/ HN株和云南株的 PCR扩增产物杂交。　结论　恶性疟原虫 Fcc1/ HN株与云南株在基因组 DNA结构上可能存在差异。     

应用聚合酶链反应在海南检测间日疟原虫的效果

目的： 建立适合疟疾流行区现场应用的ＰＣＲ 检测间日疟的方法, 并在现场与常规涂片镜检法进行比较。方法： 通过改良血样的采集及模板处理, 设计引物及优化反应条件等, 建立简便、敏感与特异的ＰＣＲ检测间日疟原虫的方法, 并在海南省疟疾流行区对３１０ 例间日疟患者与镜检法进行比较。结果： ＰＣＲ 检测间日疟原虫具有特异性, 其敏感性为１０ 个原虫／μｌ。ＰＣＲ检测和镜检法的阳性率分别为３４．２％ 和３１．９％ , 与ＰＣＲ比较, 镜检法有５ 例误诊或漏诊。结论： 此ＰＣＲ 法可用于现场检测间日疟患者。     

PCR检测蚊体内恶性疟原虫子孢子方法的建立

为建立能检测蚊体内恶性疟原虫的聚合酶链反应技术 ,根据恶性疟原虫 CSP基因序列 ,设计合成 1对引物 ,以 Chelex- 10 0煮沸法制备 DNA模板 ,采用 PCR方法 ,恶性疟原虫子孢子模板预期被扩增出 2 45 bp的 DNA条带 ,并将该法与蚊虫解剖镜检子孢子方法相比较。结果经人工感染恶性疟原虫的 31只大劣按蚊中 14只 PCR阳性 ,被扩增出预期大小的 DNA片段 ,其余 17只 PCR阴性 ;以该技术检测野外捕捉的 98只按蚊 ,结果均为阴性。 PCR法与解剖镜检法相比较 ,检测结果完全符合 ;相当于 1/ 10个阳性蚊子的模板即可满足 PCR检测。该检测体系灵敏、特异 ,对于蚊体内恶性疟原虫的检测具有一定的应用价值     

聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究

通过５ 对根据恶性疟原虫不同基因序列设计的引物筛选及７ 种从滤纸干血滴中快速制备疟原虫ＤＮＡ模板的方法的比较,以建立一种敏感、特异、简便、快速的聚合酶链反应（ＰＣＲ） 检测恶性疟原虫的方法。结果表明,根据恶性疟原虫中度重复基因序列ｐＢＲＫ１１４ 设计的引物,可从恶性疟原虫ＤＮＡ 中扩增出２０６ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段,而间日疟原虫、人白细胞ＤＮＡ均无此扩增带出现,并至少可检测出原虫血症为５ ×１０－ ７ 的感染水平,且适用于我国不同地理株恶性疟原虫的检测;滤纸干血滴样本经生理盐水溶血煮沸法处理的ＰＣＲ 扩增效果最为理想,且简易、经济、重复性好;在云南疟疾流行区采集的３６０ 份血样中,ＰＣＲ 法与镜检法符合率为９７ ．５％ 。本研究建立的ＰＣＲ 检测恶性疟原虫方法具有敏感、特异、简易和快速的特点,便于现场推广应用。