1型糖尿病人来源胰岛素原特异性T细胞克隆的建立及表型鉴定

[目的]研究1型糖尿病相关的胰岛素原（Proinsulin,PI)T细胞表位。[方法]采用有限稀释法建立糖尿病病人胰岛素原抗原特异性的T细胞克隆。^51Cr释放细胞毒性试验测定T细胞激活的HLA限制性和PI肽段中最小的抗原表位。用流式细胞仪分析其表型及表面肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apopto-sis-inducing ligand,TRAIL)的表达。[结果]建立了PI抗原特异性的CD4^ T细胞克隆TWHPI-1，CD8^ T细胞克隆TWHPI-2。前为HLADRB4*0101限制，PI最小抗原表位在PI（79-87），74.2%细胞表达TRAIL。后为HLAA1限制，PI最小抗原表位在PI（78-86），94.9%细胞表达TRAIL。[结论]HLADRB4*0101-A1可能参与IDDM的致病过程，TRAIL可能是两株T细胞克隆引起胰岛细胞死亡的因子之一。     

人类白细胞抗原-抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞的诱生及克隆

为建立一种有效诱导及克隆人类白细胞抗原(HLA)-抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法.用EB病毒转化的B淋巴母样细胞系细胞作为刺激细胞,采用长期混合淋巴细胞培养法诱导自身外周血T细胞库中抗原肽-HLA复合物特异性CTL增殖、分化,并用有限稀释法对之进行克隆.通过细胞毒实验证实获得的CD3+、CD8+T细胞克隆具有高度抗原特异性并受某些HLA型别的限制.     

人类白细胞抗原—抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞的诱生及克隆

为建立一种有效诱导及克隆人类白细胞抗原（HLA）－抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞（CTL）的方法,用EB病毒转化的B淋巴母样细胞系细胞作为刺激细胞,采用长期混合淋巴细胞培养法诱导自身外周血T细胞库中抗原肽－HLA复合物特异性CTL增殖、分化,并用有限稀释法对之进行克隆。通过细胞毒实验证实获得的CD3^ 、CD8^ T细胞克隆具有高度抗原特异性并受某些HLA型别的限制。     

恶性疟细胞毒性T淋巴细胞单表位疫苗抗原递呈细胞模型的建立

目的 构建恶性疟细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）单表位疫苗及建立抗原递呈细胞模型。方法 采用中国人群常见的HLAⅠ类分子A11限制的恶性疟（CTL）抗原表位(VTCGNGIQVR),合成其DNA序列并克隆于真核表达载体,构建CTL单表位DNA疫苗。将上述克隆在HLA－A11表型细胞株中进行表达,流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类分子表达水平。结果 上述CTL单表位DNA疫苗编码的短肽在细胞内的表达明显促进HLA－A11分子在细胞表面的表达,用流式细胞仪测定平均荧光强度可量化表达水平（P＜0.05）。结论 成功构建CTL单表位短肽表达载体,模拟体内环境建立了抗原递呈细胞模型,提示CTL表位在该细胞模型内被内源性加工和递呈,以该表位为基础的疫苗可以为HLA－A11遗传背景的人群提供免疫防护。     

小鼠MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ类分子限制性表位MAGE-3多肽疫苗的设计及其免疫效应

[目的]设计小鼠MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ类分子限制性表位黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)多肽疫苗即包含CD4~+一CD8~+T细胞表位的MAGE-3多肽抗原,并探讨其免疫效应.[方法]采用计算机模拟设计的方法,结合文献资料选择MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ类分子限制性表位的MAGE-3多肽.采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)、细胞毒性实验评价多肽诱导T淋巴细胞的增殖能力及刺激的T淋巴细胞释放细胞因子的能力.[结果]获得的联合表位多肽序列为FITC-YEEYYPLIFLDNDQETMETSEEEEYEEYYPLIF,高效液相色谱法分析多肽纯度≥90%.MAGE-3表位多肽抗原能够诱导T淋巴细胞增殖,并诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ,高于对照组(49%vs spots/10~6,P≤0.05).MAGE-3表位多肽可诱导细胞毒T淋巴细胞使42%的MFC细胞溶解破裂,高于对照组(P≤0.05).[结论]包含CD~+-CD8~+T细胞表位的MAGE-3多肽抗原在体外实验中显示有一定的免疫效应,此抗原肽可作为多肽疫苗用于对表达MAGE-3抗原的H-2K<'K>型小鼠胃癌进行免疫治疗.     

1型糖尿病的发生机制

1型糖尿病是一种器官特异性自身免疫性疾病,是基因和环境因素综合作用的结果,其发病机制复杂,主要与抗原特异性的自身反应性CD4+和CD8+T细胞选择性攻击胰岛β细胞有关,其结果是体内胰岛素水平的绝对缺乏。一些自身抗原如胰岛素、谷氨酸脱羧酶和酪氨酸磷酸酶等可能是触发该自身免疫反应的靶抗原,而细胞因子、趋化因子及炎性介质等亦参与了该免疫过程。     

慢性HBV感染患者抗原表位特异性CTL与ALT水平无关

 [目的]通过定量分析慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒（HBV）特异性的细胞毒性T淋巴细胞,探讨特异性细胞毒性T淋巴细胞水平与血清丙氨酸氨基转移酶水平和病毒复制状态的关系.[方法]从慢性乙型肝炎患者外周血分离外周血单个核细胞（PBMC）,用HLA-A2限制的HBcAg抗原表位肽-五聚体复合体及CD8单克隆抗体染色后,用流式细胞仪检测HBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞,同时检测患者的肝功能和定量分析HBV DNA.[结果]32例HLA-A2阳性的慢性乙型肝炎患者外周血均可检测到HBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞,五聚体阳性细胞占CD8阳性细胞的比例为1.3%±1.1%,统计分析抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞频率与丙氨酸氨基转移酶水平相关性不显著（r=0.163,P=0.163）.分组对比发现病毒载量低者（HBV DNA定量＜105拷贝/mL）抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞水平（1.96%±1.26%）高于病毒载量高者（0.82%±0.52%,P＜0.05）.[结论]慢性乙型肝炎患者外周血中存在抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞,抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞可能与控制HBV的复制有关,但主要肝损害并非直接由抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞引起.     

抗原肽HPV18 E77-15诱导产生特异性细胞毒T细胞的实验研究

目的探讨HLA—A2限制性表位HPV18E77—15的免疫原性。方法对抗原肽HPV18E7-15进行T2结合分析;通过体外细胞培养技术抗原肽诱导特异性CTL扩增;采用RPE标记的表位特异性五聚体和FITC标记的CD8＋抗体通过流式细胞仪检测抗原肽所诱导产生的特异性CTLs。结果抗原肽HPVl8E77—15可将T2细胞表面HLA—A＊0201分子的表达提高2．6倍;在流式细胞仪检测中,抗原肽HPV18E77—15刺激诱导产生CD8＋五聚体＋双阳性的抗原肽特异性CTLs为1．87％。结论抗原肽HPV18E77—15能够诱导HLA—A2阳性正常人外周血淋巴细胞产生特异性CTLs,表明HPV18E77-15具有一定的免疫原性。     

QLFATINSTL（93-102aa）是隐球菌抗原MP98CTL优势表位

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMC5）对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽3（93—102aa）与HLA—A＊0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA—A＊0201阳性个体PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽3QLFATINSTL（93—102aa）是抗原MP98上HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

胸腺外CD4+CD8+(DP)T淋巴细胞

T细胞在胸腺内的分化发育经历CD4 -CD8-双阴 (DN)T细胞的早期阶段、CD4 +CD8+(DP)细胞的中期阶段、经过阳性选择和阴性选择分化发育成只表达CD4 +或CD8+的单阳 (SP)细胞的后期阶段。SP细胞为成熟的T细胞 ,从胸腺迁出后移居到血液和周围淋巴器官中。既往认为在成熟的T细胞上 ,CD4抗原和CD8抗原的表达是互相排斥的 ,故根据T细胞上CD4抗原或CD8抗原的表达与否把外周T细胞分为CD4 +CD8-和CD4 -CD8+(SP)两大类。但国外自80年代以来 ,已有许多关于DPT淋巴细胞和DNT淋巴细胞研究的报道[1] 。故根据T细胞表面CD4或CD8抗原的表…     

The inhibitory effect of Chinese herb on SARS virus infection

[目的]测定H5N1病毒感染BALB/c的小鼠模型的细胞免疫动态变化,探讨病毒对机体免疫系统的影响。[方法]通过流式细胞仪测定CD3+T、CD4+T、CD8+T等细胞免疫变化。[结果]感染H5N1病毒的小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞数量下降(P<0.05),脾脏中T细胞数量下降的趋势与血液相同,CD4+T/CD8+T的比例上升,只是两者的时间有所差别。[结论]说明病毒对细胞免疫T细胞数量影响较大,而且CD8+T受到的影响更为明显,反应了机体特异性细胞免疫功能受抑制,并且彼此之间的平衡受到破坏。     

Expression of caspase-3 and TRAIL receptors in CD4+ and CD8+ T cells of SLE patients

Objective: To study the expression of caspase-3 and tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand (TRAIL) receptors in the CD4 and CD8 T cells of systemic lupus enythematosus (SLE) patients. Methods: RT-PCR was used to analyze the expression of caspase-3 and TRAIL receptors in CD4 and CD8 T cells of SLE patients and normal subjects. Results: The death domain-containing TRAIL-R1/R2 as well as “decoy“ TRAIL-R3/R4 were co-expressed in majority of CD4 and CD8 T cells in both SLE patients and normal subjects. The CD8 T cells from SLE patients showed significantly higher expression of caspase-3 and TRAIL-R2 than those from normal subjects,and the expression was correlated with the activity of the disease. Conclusion: The TRAIL-R2 signal pathway might contribute to the apoptosis of T cells in SLE.     

参贞合剂对荷瘤小鼠免疫功能的调节

目的研究参贞（人参、黄芪、女贞子）合剂对荷瘤（S180）小鼠免疫功能的调节作用。方法通过检测荷瘤小鼠T细胞亚群及吞噬细胞的功能，观察参贞合剂对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用。结果补益类中药参贞合剂上调荷瘤小鼠T细胞亚群的数目，增强吞噬细胞的活性。结论参贞合剂对荷瘤小鼠免疫功能有正向调节作用。     

Hepatitis B surface antigen-specific CD8-positive T cell clones. Antigen specificity and interleukin-2 production.

Clones of hepatitis B surface antigen-reactive CD8+ and CD4+ T cells were obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBM) of a hepatitis B immunized individual whose PBM proliferated when cultured with hepatitis B surface antigen (HBsAg). Lymphocytes were activated by culturing for 2 weeks with HBsAg and high concentrations of interleukin-2 (IL-2), then cloned in the presence of irradiated HBsAg-activated PBM and autologous Epstein-Barr virus (EBV)-transformed B cells, together with antigen and IL-2. All clones examined proliferated in an antigen-specific manner. Of 7 clones examined by flow cytometry, 4 were CD4+, CD8-; and 3 were CD4-, CD8+. Several clones produced IL-2 activity after stimulation with hepatitis B surface antigen. Since development of CD8+ T-cell clones specific for soluble antigens is difficult, the high frequency with which CD8+ cells were cloned in these experiments suggests that the cloning strategy employed might have general use for development of CD8+ clones. Availability of hepatitis B virus specific T cell clones of different phenotypes may help elucidate mechanisms of immunotolerance in hepatitis B infection.

     

Renca 条件培养基转化的调节性T细胞 对小鼠同种免疫的影响

 【目的】 探讨小鼠肾癌细胞株Renca来源的条件培养基能否诱导CD4+ CD25- T细胞转化为具有免疫抑制效能的CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞&#65377; 【方法】 培养Renca提取上清获得条件培养基,将条件培养基与普通培养液按不同比例混合培养小鼠CD4+ CD25- T细胞7 d,以流式细胞仪检测CD4+ CD25+ T细胞和Foxp3+ 细胞的比例;再次分选CD4+ CD25+ T细胞检测其抑制细胞增殖的能力,体内过继性输入观察对移植物存活时间&#65380;局部排斥反应和迟发性超敏反应的影响&#65377;【结果】 与对照组相比,混合培养基显著增加培养体系中CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞的比例(P < 0.05),在一定范围内(≤75%)呈比例依赖关系;随转化性CD4+ CD25+ T细胞比例增加效应T细胞增殖能力减弱;体内输注显著延长移植物的存活时间(P < 0.05),达(29.6 ± 1.4) d,组织学观察显示能明显抑制局部排斥反应&#65377;【结论】 Renca条件培养基能诱导CD4+ CD25- 细胞转化为 CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞,被转化细胞在体内和体外均能发挥免疫抑制作用&#65377;     

CD4+CD25+调节性T细胞对直肠癌过继免疫治疗效应细胞的影响和作用

目的 探讨CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）在直肠癌过继免疫治疗中对免疫杀伤细胞的负性调节作用。方法 利用流式细胞仪分别检测15例直肠癌患者和健康志愿者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的含量;分离提取直肠癌患者外周血CD4+T细胞,免疫磁珠法去除 CD4+CD25+调节性T细胞,同灭活的LOVO直肠癌细胞珠共培养并扩增为肿瘤抗原特异性CTL,以LOVO细胞为靶细胞行肿瘤杀伤实验,观察各实验组CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果 直肠癌患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞总数的（11.12±0.57）%,显著高于健康对照组（8.77±0.66）%（t=2.687,P＝0.012）;去除Treg细胞后诱导产生的抗原特异性CTL对靶细胞的杀伤效率为（33.74±4.42）%,显著高于未去除Treg细胞的对照组CTL的杀伤效率[(17.39±2.54)%; t=3.206, P=0.0034]。结论　直肠癌患者外周血中调节性T细胞含量明显增高,并且对肿瘤抗原诱导的CTL的免疫杀伤功能具有明显抑制作用。     

DETECTION OF B LYMPHOMA CELLS UNDERGOING APOPTOSIS BY ANNEXIN—V ASSAY

Objecte.To quantitatively analyze apoptotic and secondary necrotic cells under apoptosis conditions.Methods.The cells of Burkitt lymphoma (BL) cell line Raji were incubated with 1.0μmol/L dexamethaone(DEX) for 2,4 and 8h respectively,then stained with Annexin V-FITC (fluorescein isothiocyanate conjugated)which was used to detect the exposed phosphatidylserine(PS) on the epimembrane resulting from a loss of phospholipid asymmetry in the early stage of apoptosis ,and also stained with propidium iodide(PI)which allows analysis of secondary necrotic cells related with cell membrane and DNA damage that probably represent late stage of apoptosis,then apoptotic cells were quantified by flow cytometry(FCM).Furthermore,Annexin^ /PI^- and Annexin^ /PI^ cells were sorted by fluoresence-activated cell sorter(FACS),and identified by electron microscopy(EM)and DNA gel electrophoresis.Reuslts.The percentage of apoptotic cells was fund to increase with the incubation time(r=0.97).This method was senitive with low detection limit(0.02%) ,and was reproducible with low coefficient variance (CV)(4.2%).Meanwhile,the Annexin^ /PI^- and Annexin^ /PI^- cells were identified as apoptotic and necrotic cells under EM,and DNA extracted from the Annexin^ /PI^- cell was characteriazed by “ladder pattern“.Conclusions.Annexin-V assay is a specific,sensitive,accurate,reproductive and quantitative method for analyzing apoptotic cells.     

大鼠间充质干细胞对BALB/c小鼠体外淋巴细胞实验的影响

目的 研究大鼠间充质干细胞(MSC)对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖和CD4+CD25+调节性T细胞亚群的变化。方法 分离、扩增SD大鼠MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定。取第5代MSC与分离的小鼠淋巴细胞在刀豆蛋白(ConA)刺激下共培养5天 ,流式细胞仪测定细胞增殖,CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例的变化。结果 当淋巴细胞: MSCs在1:10及1:50时均可抑制ConA刺激下可抑制小鼠淋巴细胞增殖,淋巴细胞: MSCs在1:10 时CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例明显升高。结论 大鼠MSC具有异种基因免疫抑制作用