基于悬浮点阵技术的新型EGFR基因突变检测方法的建立和应用

目的构建基于悬浮点阵技术的新型表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检测方法,检测并分析非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)相关的EGFR基因突变状况。方法选取61例经影像学和病理学检查确诊的NSCLC患者作为研究对象,手术后留取新鲜肺癌组织,提取基因组DNA,采用多重聚合酶链式反应(PCR)对组织样本的EGFR基因18、19、20和21号外显子中包含8种高频突变位点的特异片段进行扩增,并经多重连接酶检测反应(LDR)以特异性探针对扩增片段中的突变进行连接,再基于悬浮点阵技术平台对连接产物进行检测,最后通过DNA测序对检测结果进行验证。结果在61例NSCLC组织样本中,运用PCR-LDR联合悬浮点阵技术共检出EGFR基因突变19例,突变率为31.1%,其中外显子19缺失突变E746-A750 del(1)、E746-A750 del(2)各1例,外显子20点突变T790M 1例,外显子21点突变L858R 14例、L861Q2例,经DNA测序验证完全正确。结论运用PCR-LDR联合悬浮点阵技术初步建立了一种新型的EGFR基因突变检测方法,能同时准确检测EGFR基因中的8种高频突变...     

老年晚期非小细胞肺癌EGFR基因突变情况的研究

目的 通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)的人表皮生长因子受体(EGFR)基因突变,以探讨老年晚期患者的EGFR突变类型及突变特征。方法 45例经CT引导下经皮肺穿刺术的NSCLC的病理组织标本,经基因测序法检测其EGFR基因突变情况,并对EGFR基因各外显子的突变类型进行统计分析。结果 45例NSCLC标本,EGFR基因突变率为37.8%,其中外显子19约占52.9%;外显子21占41.2%,两者合占基因总突变数的94.1%。外显子19突变主要发生在DNA链上的碱基序列第746～753位密码子上,均为碱基删除突变,其中,最常见的突变类型是del E746-A750;外显子20突变1例,突变发生在DNA链上的碱基序列第768位密码子上的错义突变;外显子21突变发生在DNA链上的碱基序列第848、858、861位密码子上的错义突变,而L858R是最常见类型。突变阳性率,男性22.7%,女性52.2%;吸烟者15.4%,非吸烟者46.9%;鳞癌14.2%,腺癌48.4%;Ⅲ期26.5%,Ⅳ期36.8%,EGFR基因突变率在性别比例、吸烟情况以及病理类型之间的比较,差异均有显著性学意义(P<0.05);在肺癌分期的比较,差异无意义(P>0.05)。结论 (1)EGFR基因突变约占NSCLC总数的37.8%, 以外显子19、21突变为主。(2)EGFR主要突变类型为碱基删除突变、错义突变,大部分突变发生在女性、非吸烟、腺癌患者,其中,半数以上存在复合突变。     

人非小细胞肺癌组织中检测表皮生长因子受体突变两种方法的比较

目的:通过免疫组织化学染色与实时荧光定量PCR检测表皮生长因子受体(EGFR)突变的比较,探讨两种检测方法的一致性及在非小细胞肺癌(NSCLC)临床检测中的应用价值。方法:随机选择36例NSCLC存档石蜡组织,采用特异性突变抗体(E746-A750del和L858R)的免疫组织化学染色方法和Roche商品化的cobas?EGFR PCR检测试剂盒检测EGFR的突变状态。结果:EGFR突变蛋白阳性定位于肿瘤细胞质和或胞膜。免疫组织化学检测显示NSCLC中EGFR突变阳性率为47.22%(17/36),其中鳞癌的突变率为9.09%(1/11),腺癌的突变率为64.00%(16/25),二者的差异有显著性(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测NSCLC中EGFR突变阳性率为50.00%(18/36),其中鳞癌的突变率为18.18%(2/11),而腺癌的突变率为64%(16/25),二者的差异有显著性(P<0.05)。免疫组织化学染色与实时荧光定量PCR检测EGFR突变具有极好的一致性(κ=0.833,P<0.01),并且检测到的主要突变位点都是19号外显子的缺失突变(E746-A750del)和21号外显子的点突变(L858R)。结论:EGFR突变特异性抗体的免疫组织化学检测是一种可在NSCLC中进行EGFR突变筛查并对EGFR-TKI治疗快速反应的方法,具有检测费用较低、检测时间较短且结果易于判读,是一种可以在临床进行广泛推广的检测方法。EGFR突变在肺腺癌中更为常见。     

联合探针法快速检测EGFR突变

目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变尤其是19外显子E746_A750del和21外显子 L858R突变与接受TKIs治疗的非小细胞肺癌患者的临床预后相关,这就意味着检测EGFR突变在临床治疗中起着重要作用?因此,建立一种快速简单而经济的检测EGFR突变的方法能够有效缓解患者经济负担?方法:通过不对称PCR和联合探针(APCR-JP)快速检测EGFR突变?本研究中收集37例非小细胞肺癌患者肿瘤组织进行APCR-JP检测?结果:发现17例(45.9%)19外显子突变和8例(21%)21外显子突变,此结果与测序结果一致?结论:APCR-JP能够检测EGFR突变,为临床治疗提供依据?     

105例非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变分析

目的 分析表皮生长因子受体(EGFR)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的基因突变率及突变类型.方法 收集105例肺癌组织和80例正常肺组织,采用PCR扩增和基因测序方法,对组织DNA中EGFR外显子19和21进行基因突变分析.结果 非小细胞肺癌组织中EGFR基因突变率为33.33%(35/105),其中外显子19占42....     

非小细胞肺癌患者胸腔积液肿瘤细胞EGFR基因突变检测及其在治疗中的价值

目的 对晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)并发恶性胸腔积液的患者利用胸腔积液中的肿瘤细胞检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因19、20及21外显子的突变,了解EGFR的突变率以及与表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase factor inhibitors,EGFR-TKIs)疗效的相关性.方法 收集23例晚期NSCLC患者的恶性胸腔积液,经反复离心后取沉淀细胞行石蜡包埋,巢式PCR法扩增EGFR 19、20及21外显子,取扩增片段进行DNA测序及分析.结果 23例NSCLC患者中8例检测到EGFR基因突变,突变率为34.8%.其中4例为外显子19的缺失突变,2例为外显子21的点突变,2例患者检测到复合突变.EGFR突变在不吸烟者(7/12,58%)高于吸烟者(1/11,9%)(P<0.05),EGFR突变与性别、年龄无明显相关性.EGFR-TKIs治疗有EGFR基因突变的患者与无突变的患者相比有较高的疾病控制率(100% vs 25%,P<0.05),有突变患者的中位无疾病进展时间明显长于无突变患者(9.5月vs 2.8月),但因病例数少未能进行统计学检验.结论 恶性胸腔积液可以作为NSCLC患者进行EGFR基因突变的检测标本,胸腔积液肿瘤细胞EGFR基因突变主要位于外显子19及21,外显子19主要为缺失突变,外显子21主要为点突变.有EGFR基因突变的患者接受EGFR-TKI治疗的疗效好于无突变患者,EGFR基因突变可以作为是否接受TKI治疗的预测因子.     

中国北方地区非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变的研究

目的研究中国北方地区非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌组织表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的情况。方法采用PCR扩增和基因测序,检测93例NSCLC患者癌组织EGFR基因外显子19和21的突变情况,并分析其突变与临床特征的关系。结果93例组织标本中共检测到21例EGFR突变(22.6%),其中16例发生在外显子19的缺失突变,5例发生在外显子21的错义突变。男性与女性,吸烟者与非吸烟者,不同病理分型的NSCLC患者基因突变率间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论中国北方地区NSCLC患者癌组织的EGFR基因在腺癌、女性、非吸烟者中突变率高,这类患者更适宜靶向药物的治疗。     

非小细胞肺癌患者肿瘤组织及外周血EGFR基因突变研究

目的:调查非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR基因突变的情况,评价EGFR突变检测对NSCLC个体化治疗的指导意义。方法:收集39例经手术治疗的NSCLC患者肿瘤组织、正常肺组织及外周静脉血标本,提取基因组DNA后,采用PCR扩增和基因测序方法检测EGFR基因外显子19、20和21基因突变情况,并用SPSS11.5软件进行统计学分析。结果:EGFR在正常肺组织中都未检出基因突变;肺癌组织中EGFR基因突变率为30.8%(12/39),以杂合性突变为主(91.7%,11/12),纯合性突变少见(8.3%,仅1例),外显子19、20和21分别占突变总数的41.7%(5/12),25.0%(3/12)和33.3%(4/12);外周血中检出的EGFR的突变率为33.3%(4/12),全部为肿瘤组织中存在突变者;EGFR基因突变多见于女性、腺癌及腺鳞癌、"不吸烟"患者,与年龄、临床分期均无明显相关性(P>0.05),与吸烟高度相关(P<0.01)。结论:NSCLC患者EGFR基因突变率较高,EGFR基因突变检测对NSCLC患者个性化治疗可能有指导意义。     

运用ARMS法检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变

目的探讨应用突变特异性扩增系统法(ARMS)检测非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变.方法收集20例芜湖中医院2014年1月至12月NSCLC患者肿瘤样本,采用ARMS法检测EGFR基因18、19、20、21号外显子突变情况.结果在20例NSCLC患者中,18例ARMS法检测成功;ARMS法检测本群患者EGFR突变率为44.4％(8/18).在所有突变类型中,19外显子缺失突变3例,20外显子1例插入突变(S768I),20号外显子T790M错义突变2例,21号外显子错义突变(L858R)3例,其中1例同时出现20号外显子T790M突变及21号外显子(L858R)突变.结论ARMS法检测EGFR基因突变敏感,整个实验过程小于3h,操作简单,能够满足临床快速检测的要求,易于普及,而且ARMS可以检测到1％含量的突变DNA,敏感性高.特别是对于小标本及肿瘤组织含量少的标本有明显的优势.     

表皮生长因子受体基因突变对非小细胞肺癌患者肿瘤生长、转移及生存率的影响

目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因突变对非小细胞肺癌(NSCLC)患者预后的影响.方法 收集厦门大学附属中山医院2005年12月至2009年8月107例NSCLC患者的手术切除癌组织标本,采用PCR扩增和基因测序方法检测EGFR外显子18～21突变,分析基因突变对患者肿瘤生长、转移及生存率的影响.结果 107例患者中检出EGFR基因突变者30例(28.0%),其中外显子18突变1例,外显子19突变8例,外显子21突变20例,外显子18和19多重(3个)突变1例.EGFR基因突变患者肿瘤生长速度的M(Q1～3)为0.42(0.17-1.04)mm/d,明显快于基因正常患者[0.21(0.19～1.00)mm/d,P<0.05];淋巴结转移发生率和肺外器官转移发生率与基因正常患者比较差异无统计学意义(P>0.05).EGFR基因突变和基因正常患者术后平均生存时间分别为(18.2±8.9)和(25.5±7.8)个月,1、2、3年生存率分别为62.2%、47.7%、46.9%和72.2%、57.3%、56.3%,Log-rank检验显示两者间生存情况差异无统计学意义(X2=0.59,P>0.05).结论 EGFR基因突变可以促进NSCLC生长,但不是影响预后的因素.     

HRM方法检测非小细胞肺癌患者胸水标本癌细胞基因突变的临床意义

[目的]探讨应用HRM方法检测非小细胞肺癌患者胸水标本癌细胞EGFR、KRAS基因突变用于指导EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂治疗的可行性.[方法]收集36例非小细胞肺癌患者胸水标本,常规提取DNA,HRM方法检测KRAS基因第2外显子、EGFR基因第19和21外显子突变.统计分析胸水标本与前期检测过的非小细胞肺癌组织KRAS、EGFR突变率差异.[结果]胸水标本36例中,2例(5.6％)KRAS突变,10例(27.8％) EGFR突变(其中EGFR第19和21外显子突变各5例).前期检测过的非小细胞肺癌组织KRAS和EGFR突变率分别为5.8％和36.3％.KRAS和EGFR突变率在胸水标本与前期非小细胞肺癌组织中差异均无显著性意义(P＞0.05).[结论]对难以获得肺癌组织标本的非小细胞肺癌患者可应用HRM方法检测胸水标本筛查KRAS、EGFR基因突变,指导EGFR酪氨酸激酶受体抑制剂应用.     

改良Blocker PCR检测EGFR-TKI耐药后非小细胞肺癌血浆EGFR T790M突变的价值

 目的   探讨改良PCR(Blocker PCR)方法在晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者血浆游离DNA(cell free DNA,cfDNA)中检测继发EGFR T790M突变的应用价值。方法   采用Blocker PCR方法对127例表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药后肺癌患者的血浆标本行EGFR敏感突变和T790M突变检测,统计T790M突变的检出率;为验证Blocker PCR 血浆检测的可靠性,部分患者血浆标本行二代测序(next generation sequencing,NGS)和Blocker PCR配对比较;获得配对血浆和组织的病例行Blocker PCR配对检测。结果   在127例采用Blocker PCR方法检测的EGFR-TKI耐药NSCLC患者中,T790M耐药突变的检出率为40.15% (51/127),其中21.56% (11/51)为单纯T790M耐药突变,78.44% (40/51)为T790M合并原有EGFR敏感突变。组织与血浆配对检测中,EGFR-TKI耐药后二次活检组织标本T790M的检出率为54.54% (6/11),血浆T790M的检出率为43.75% (14/32)。在同时行Blocker PCR 和二代测序基因检测的18例患者中,敏感突变位点及T790M突变位点在两种检测方法中的一致率均为100%。结论   在EGFR-TKI耐药后的NSCLC患者中使用Blocker PCR 检测血浆T790M突变是对组织活检的重要补充。     

Epidermal growth factor receptor genotype in plasma DNA and outcome of chemotherapy in the Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer

Background  The genotype of epidermal growth factor receptor (EGFR) is associated with tyrosine kinase inhibitor and effectiveness of therapy, but its role in cytotoxic chemotherapy is still unknown. Previous studies indicated that certain EGFR mutations were associated with response and progression free survival following platinum based chemotherapy. Our recent studies have identified that EGFR genotypes in the tumour tissues were not associated with response to the first-line chemotherapy in Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). In this study, we investigated associations of EGFR genotypes from plasma of patients with advanced NSCLC and response to first-line chemotherapy and prognosis.

Methods  We enrolled 145 advanced NSCLC patients who had received first-line chemotherapy in our department. We examined plasma EGFR genotypes for these patients and associations of EGFR mutations with response to chemotherapy and clinical outcomes.

Results  There were 54 patients with known EGFR mutations and 91 cases of wild types. No significant difference was detected in the response rate to first-line chemotherapy between mutation carriers and wild-type patients (37.0% vs. 31.9%). The median survival time and 1-, 2-year survival rates were higher in mutation carriers than wild-types (24 months vs. 18 months, 85.7% vs. 65.7% and 43.7% vs. 25.9%, P=0.047). Clinical stage (IV vs. IIIb), response to the first-line chemotherapy (partial vs. no) and EGFR genotype were independent prognostic factors.

Conclusion  Plasma EGFR mutations in the Chinese patients with advanced NSCLC is not a predictor for the response to first-line chemotherapy, but an independent prognostic factor indicating longer survival.

     

液相芯片技术检测非小细胞肺癌多基因突变

目的 建立基于高通量液相芯片技术、可同时检测p53、p16、视网膜母细胞瘤(Rb)和表皮生长因子受体(EGFR)基因热点突变的方法,并探讨其在非小细胞肺癌(NSCLC)分子诊断中的意义.方法 针对p53、p16、Rb和EGFR基因热点突变位点,分别设计正常序列和突变序列探针,将探针固定于标记不同比例荧光物的微球上.分别提取65例NSCLC患者(Ⅰ期23例,Ⅱ期20例,Ⅲ期22例)癌组织标本和其中20例患者癌旁正常组织标本基因组DNA,PCR扩增p53、p16、Rb和EGFR基因.将PCR产物与含寡核苷酸探针的微球混合后用Luminex 100多功能流式点阵仪进行流式荧光检测分析.结果 单独检测p53、p16、Rb和EGFR基因突变时,NSCLC标本突变检出率分别为53.8%(35/65)、20.0%(13/65)、7.7%(5./65)和35.4%(23/65);癌旁正常组织标本为5.0%(1/20)、5.0%(1/20)、0和0.而四基因联合检测,敏感性为81.5%(53/65),特异性为90.0%(18/20),准确性为83.5%(71/85);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NSCLC标本突变检出率分别为78.3%(18/23)、80.0%(16/20)和86.4%(19/22).结论 成功建立了具有较高敏感性和特异性、可同时检测临床NSCLC标本多基因突变的液相芯片检测方法,该方法有助于提高NSCLC分子诊断的效率,并可能有助于NSCLC的早期诊断.     

非小细胞肺癌18F-FDG摄取与EGFR突变的关系

【目的】 探讨非小细胞肺癌原发病灶18F氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)摄取与表皮生长因子受体突变的相互关系,及应用最大标准化摄取值预测EGFR突变以期指导临床酪氨酸激酶抑制剂的应用。【方法】从2006年11月到2010年9月,收集66例在抗肿瘤治疗之前行EGFR突变检测及PET/CT扫描的NSCLC患者,用SUVmax描述原发病灶的18F-FDG摄取情况,采用荧光定量PCR法检测患者EGFR的突变情况,分析FDG摄取与EGFR突变的关系。【结果】 本组病例中EGFR的19号及21号外显子的突变率为33%,突变型患者原发灶的SUVmax低于野生型患者(10 ± 5,14 ± 6,P = 0.006)。SUVmax与EGFR突变存在负相关关系(r = -0.344,P = 0.005)。在用SUVmax预测EGFR突变时,受试者工作特征曲线下面积(area under receiver operating characteristic curve,AUC)是0.71,P = 0.006;当SUVmax取界值8.8时,约登指数达到最大值为0.44,SUVmax低于此界值的患者比高于此值的患者更容易发生EGFR突变(71%,20%,P = 0.000)。【结论】 原发病灶18F-FDG摄取与NSCLC患者EGFR突变存在着相关关系,低SUVmax的患者更容易发生EGFR突变,对非小细胞肺癌患者是否适用TKI治疗提供了一定的依据。     

非小细胞肺癌 EGFR基因突变与ERCC1、TYMS mRNA表达相关性的研究

目的：探讨非小细胞肺癌表皮生长因子受体（EGFR）基因突变与核苷酸切除修复交叉互补基因1（ERCC1）、胸苷酸合成酶（TYMS） mRNA表达的相关性。方法收集该科2013年2～12月符合入组条件的NSCLC患者97例,肿瘤组织标本由术中切取或穿刺获得。使用xTAG-液相芯片法检测EGFR（E18、E19、E20、E21）基因突变,使用分支DNA-液相芯片法检测ER-CC1、TYMS mRNA表达水平,并分析EGFR基因突变与 ERCC1、TYMS mRNA表达水平的相关性。结果97例检测样本中, EGFR基因突变29例,突变率为30％（29／97）,女性、无吸烟史、腺癌患者EGFR基因突变检出率较高（P＜0．05）。EGFR突变与ERCC1 mRNA表达有相关性（χ2＝4．088,P＜ 0．05）,与 TYMS mRNA 表达无相关性（χ2＝ 0．265,P＞ 0．05）。结论 NSCLC EGFR基因突变与ERCC1 mRNA表达存在相关性,与TYMS mRNA表达无相关性。     

老年人肺癌中VEGF、EGFR和MMP-9蛋白的表达及其临床意义

目的本文旨在通过对VEGF、EGFR及MMP-9蛋白表达的研究,探讨VEGF、EGFR及MMP-9在老年人非小细胞肺癌(NSCLC)发生中所起的作用。方法对确诊的136例NSCLC组织石蜡标本及癌旁正常肺组织用免疫组化方法进行VEGF、EGFR和MMP-9蛋白表达的检测。结果 136例NSCLC组织中VEGF、EGFR及MMP-9蛋白的阳性表达率分别为79.4%、75.0%及68.4%,在正常肺组织中的表达率分别为16.0%、12.0%及8.0%,NSCLC与良性肺组织VEGF、EGFR及MMP-9蛋白表达率相比较,差异有统计学意义(P<0.01);NSCLC中VEGF、EGFR及MMP-9蛋白表达均呈正相关。结论 NSCLC中VEGF、EGFR和MMP-9蛋白表达率较高,三者共同促进NSCLC的发展。     

非小细胞肺癌EGFR基因突变与吉非替尼疗效的相关性研究

目的探索铜陵地区非小细胞肺癌EGFR基因突变率,观察EGFR基因的突变与吉非替尼的疗效的关系。方法2009年1月至2010年12月安徽省铜陵市人民医院诊治的符合入组条件的晚期NSCLC 34例,对其病理标本使用ARMS法进行EG-FR基因突变18～21外显子的检测。所有病例均给予口服吉非替尼250 mg/d,1次/d,持续服用直到疾病进展或出现不可耐受的毒副反应。观察症状的控制、临床疗效、无疾病进展生存时间(PFS)、总生存时间(OS)和不良反应。结果铜陵地区34例NSCLC患者EGFR基因突变的检出阳性率59.09%。34例吉非替尼治疗NSCLC疗效总有效率(16/34)47.06%,经Fisher精确检验显示无吸烟史、EGFR突变、肺内有播散有效率高,与有吸烟史、无EGFR突变、无肺内有播散者相比,差异有统计学意义(P0.05)。Logistic多因素回归分析显示仅EGFR突变、肺内有播散为独立影响因素。Cox模型回归分析显示EGFR基因突变使肿瘤进展的风险降低了70%。结论铜陵地区NSCLC EGFR基因突变率较高,EGFR突变可以较好地预测吉非替尼治疗晚期NSCLC的疗效,降低了肿瘤进展的风险,且安全性好。