稳定表达PLCγ1 siRNA慢病毒的构建及对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的 制备在人大肠癌系LoVo中稳定抑制磷脂酶C(PLC)γ1的重组慢病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用.方法 制备产生PLCγ1 siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系.应用Westem-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析.应用流式细胞仪分析PLCγ1 siRNA对细胞凋亡的影响.结果和结论 PLCγ1 siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,显著增加了5-FU诱导的凋亡.     

磷脂酶Cγ1及NF-κB在结直肠癌细胞与基质黏附中的作用及信号转导机制

目的:研究磷脂酶Cγ1(PLCγ1)及NF-κB在结直肠癌细胞与细胞外基质黏附中的作用及其信号转导机制.方法: PLC抑制剂U73122用于研究PLCγ1在高转移的人结肠癌细胞LoVo和低转移的SW480细胞中对于细胞-基质黏附的影响.吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)用于研究NF-κB在结直肠癌细胞与基质黏附中的作用. PLCγ1在结直肠癌细胞中作用的信号转导机制采用蛋白质印迹及凝胶迁移率变动分析(EMSA).结果:抑制PLCγ1对SW480细胞与基质的黏附无明显影响.但在LoVo细胞中,PLCγ1和NF-κB的抑制均可显著降低细胞与基质的黏附(P<0.05)并呈剂量依赖性, 且抑制作用可被EGF部分恢复.蛋白质印迹分析显示EGF可刺激PLCγ1的磷酸化.EMSA结果显示,抑制PLCγ1可以抑制EGF刺激的NF-κB的激活.结论:EGF-PLCγ1-NF-κB 信号通路在高转移的结肠癌细胞与基质的黏附中发挥重要作用.     

miR-200a在结直肠癌细胞系中的表达及其对高转移细胞系Lovo的影响

目的检测结肠癌细胞系中miR-200a对高转移细胞系Lovo的影响。方法采用荧光定量PCR法检测6种结肠癌细胞系
HCT116、HT29, LS174T、SW480、SW620和Lovo中miR-200a的表达水平,在高转移细胞系Lovo中瞬时转染miR-200a mimics
使其高表达miR-200a,检测高表达miR-200a后Lovo细胞增殖、迁移、细胞同质黏附能力和凋亡等情况的变化。结果miR-200a
在6种细胞系中存在差异性表达,其中具有高转移潜能的Lovo中表达最低,成瘤但不转移的细胞系HCT116表达最高。在Lovo
细胞高表达miR-200a后,Lovo细胞的增殖和迁移能力明显减弱、细胞同质黏附能力增强且凋亡增加。结论miR-200a在结肠
癌细胞系中表达失常,其作用可能与结肠癌细胞的侵袭和转移有关,高表达miR-200a 能抑制Lovo细胞增殖和迁移、增强细胞
间黏附能力、促进凋亡,其分子机制有待进一步研究。
     

内皮素3基因对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨内皮素3(endothelin 3,EDN3)基因对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响及其相关机制.方法 实时荧光定量PCR检测EDN3 mRNA在人结直肠癌组织及对应癌旁组织中的表达情况,半定量PCR检测EDN3及内皮素受体B(endothelin receptor B,EDNRB) mRNA在结直肠癌细胞(CaC02、LoVo、HT-29)中的表达情况.将包装过载体pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro-EDN3的病毒感染至结直肠癌细胞LoVo,MTS、克隆形成法、划痕法、Transwell检测EDN3对细胞增殖、克隆、迁移和侵袭能力的改变.Western blot检测LoVo中p-ERK1/2和t-ERK 1/2蛋白改变.结果 EDN3在人结直肠癌组织和细胞中表达降低.表达EDN3基因的重组载体成功感染至LoVo细胞.MTS和克隆实验结果显示,实验组和对照组细胞增殖和克隆形成差异无统计学意义(P＞0.05),划痕实验和Transwell实验提示实验组细胞迁移和侵袭能力明显低于对照组(P＜0.01).Western blot检测结果显示磷酸化的ERK1/2蛋白表达下降(P＜0.01).结论 EDN3在结直肠癌组织和细胞中表达降低,过表达EDN3能抑制结直肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与ERK1/2信号通路有关.     

慢病毒转染KISS1基因对人结直肠癌HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的：探讨慢病毒转染KISS1基因过表达对结直肠癌HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并阐明其作用机制。方法：选取KISS1基因低表达结直肠癌细胞株,构建慢病毒载体并转染KISS1基因,分为对照组（PBS处理）、空载体组（转染空载体）和过表达组（转染含KISS1载体）。荧光显微镜检查转染的荧光率（MOI）,Real-time PCR和Western blotting法检测各组细胞中KISS1mRNA和蛋白（metastin）的表达量,采用CCK-8法检测各组细胞增殖活力,Transwell小室法检测各组细胞侵袭和迁移能力。结果：LoVo、SW620 、SW480、HCT-116和HT29细胞中,HCT-116细胞中KISS1mRNA和蛋白表达量相对最低,因此筛选其作为研究载体。包装有KISS1基因的慢病毒感染HCT-116细胞后,能够稳定表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因,MOI均>80%。与对照组和空载体组比较,过表达组细胞中KISS1 mRNA和蛋白表达量明显升高（P<0.05）,细胞增殖活力明显降低（P<0.05）,侵袭能力和迁移能力亦明显下降（P<0.05）;与对照组比较,空载体组细胞增殖活力、侵袭能力和迁移能力差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：慢病毒转染KISS1基因能够过表达KISS1蛋白及抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力,其机制可能与KISS1蛋白表达有关。     

Effect of tumor suppressor gene KAI1 on the biological behaviors of human colorectal carcinoma]

OBJECTIVE: To determine whether the expression of tumor suppressor gene KAI1 can suppress the invasive or metastatic ability of colorectal carcinoma cells. METHODS: KAI1 cDNA was transfected into highly malignant colorectal carcinoma cell line LoVo, which had low levels of endogenous KAI1 expression. The expressions of KAI1 mRNA and protein were determined by immunohistochemistry and in situ hybridization, and the biological behaviors of the KAI1-transfected LoVo cells were investigated by cell-cell adhesion, cell-matrix adhesion and invasion assays. RESULTS: KAI1 expression significantly suppressed the metastatic potential of KAI1-transfected LoVo cells, whose metastasis suppression was correlated with the increased adhesion to homotypic cells and reduced tumor adhesion to extracellular matrix components. KAI1 expression significantly suppressed the in vitro cell invasion in KAI1-transfected LoVo cells. CONCLUSION: KAI1 might function as inhibitor of colorectal carcinoma metastasis.     

ADAMDEC1对人脑胶质瘤U87细胞生物学行为的影响

目的 研究解聚素金属蛋白酶家族癸蛋白1(ADAM-DEC1)对人脑胶质瘤U87细胞增殖、黏附、侵袭、迁移和凋亡的影响及可能机制.方法 实验组(ADAMDECl-RNAi)人脑胶质瘤U87细胞用携带特异性siRNA的慢病毒感染来下调ADAMDEC1的表达,对照组(CONTROL-RNAi)用阴性对照慢病毒感染,通过观察GFP荧光的表达情况来判定转染效率,采用Real-time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测稳定转染的U87细胞ADAMDEC1基因的表达情况,CCK-8法检测下调ADAMDEC1表达后细胞增殖及黏附能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭及迁移能力的变化,流式细胞技术检测细胞凋亡的变化.结果 与CONTROL-RNAi相比,ADAMDECl-RNAi mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.01) ;CCK-8法检测结果显示下调ADAM-DEC1表达能够显著抑制U87细胞的增殖(P< 0.05)和黏附能力(P<0. 01) ;Transwell检测结果显示下调ADAMDEC1表达能够显著抑制U87细胞的侵袭和迁移能力(P<0. 01);流式细胞术检测结果显示下调ADAMDEC1表达能够促进 U87细胞的凋亡(P<0.01).结论 在体外细胞培养试验中,下调ADAMDEC1表达能够显著抑制U87细胞的增殖、黏附、侵袭、迁移能力,促进U87细胞的凋亡.     

PD98059通过诱导PUMA表达增强肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的敏感性

目的 体外实验探讨MEK1特异性抑制剂PD98059对奥沙利铂药物治疗作用的影响及PUMA在这一过程中的作用.方法 MTT法检测转染MEK1 active质粒后及不同药物处理后对LoVo细胞增殖率的影响;Western blot检测奥沙利铂和/或PD98059处理后PUMA蛋白的表达和ERK的活性;利用表达反义PUMA基因的细胞克隆抑制PUMA的表达后检测对PD98059和奥沙利铂诱导凋亡作用的影响.结果 在肠癌LoVo细胞中,ERK的激活增加细胞的增殖率;奥沙利铂可以抑制ERK的活性,并呈剂量依赖关系;PD98059可以协同奥沙利铂抑制细胞增殖率的作用;奥沙利铂和PD98059可以协同诱导PUMA的表达;抑制PUMA的表达可以减弱奥沙利铂和PD98059诱导的LoVo细胞的凋亡.结论 PD98059通过诱导PUMA表达增强肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的敏感性.     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的：建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株，观察Fas基因在转导前后的表达，方法：采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间，以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo ,用G418筛选克隆细胞，以dot blotting,Westting blotting检测转导细胞Fas基因的表达，结果：成功建立了Fas基因表达株，转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株，转导细胞增殖速度，倍增时间，对数生长期等均比非转导株更为缓慢，但无显著性差异，在Fas抗体作用下，转导株细胞生长明显受到抑制，有非常显著性差异，结论：Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态，通过真核表达载体介导，Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达，Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

抑癌基因KAI1对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的研究抑癌基因KAI1对大肠癌细胞生物学特性的影响。方法用KAI1 cDNA质粒转染低表达KAI1基因的人大肠癌LoVo细胞。免疫组化和原位杂交检测转染后mRNA和蛋白的表达,利用体外肿瘤同质性粘附、异质性粘附实验和肿瘤侵袭模型等方法,检测KAI1/CD82对大肠癌粘附与侵袭的影响;以空白质粒转染组为对照组。结果体外实验发现转染KAI1质粒的LoVo细胞同质性粘附能力高于对照组,异质性粘附及侵袭能力明显低于对照组。抑癌基因KAI1对肿瘤的增殖能力没有影响。结论KAI1基因表达的减少可以导致大肠癌细胞同质性粘附降低,对基底膜粘附及侵袭转移的能力增加。因此,KAI1基因可以作为大肠癌的一种转移抑制基因。     

Hsa-miR-186在结肠癌细胞中的表达及作用

目的检测hsa-miR-186在结肠癌组织及细胞中的表达,探讨hsa-mir-186对结肠癌细胞生物学特性的影响及作用。方法
应用实时荧光定量PCR 检测了miR-186 在12 对配对的结肠癌组织、癌旁组织和5 株结肠癌细胞中的表达情况;扩增包含
miR-186前体序列在内的基因片段,并将其克隆至PLVTHM载体,将PLVTHM- miR186质粒转染SW620细胞,流式分选慢病
毒感染的SW620细胞;CCK-8法、划痕实验和Transwell检测细胞检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Western Blot检测靶基因
YY1 蛋白水平的表达。结果与癌组织相比,12 例癌组织中miR-186 的平均表达量为0.0024±0.0027,显著低于癌旁组织的
0.066±0.068,P=0.008;miR-186 在高转移潜能的人结肠癌细胞SW620 和LOVO相对表达量分别为0.118±0.138 和0.157±
0.001,与在低转移潜能HT-29 细胞中表达量1.000 ± 0.00,差异具有统计学意义P<0.05;质粒双酶切及测序鉴定
PLVTHM-hsa-miR186重组质粒构建成功;荧光定量PCR表明稳定过表达miR-186的结肠癌细胞株SW620构建成功,且过表达
miR-186后降低了细胞的增殖、迁移及侵袭能力,差异均具有统计学意义P<0.05。稳定过表达miR-186的细胞中,miR-186的表
达明显高于对照组和未处理组,YY1蛋白质水平有所下降。结论hsa-miR-186在结肠癌组织以及在高转移潜能的人结肠癌细
胞SW620、LOVO中低表达,具有类似抑癌基因的作用;成功构建PLVTHM-miR186慢病毒重组质粒,并稳定转染结肠癌细胞
SW620,抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力。miR-186调控YY1表达可能是抑制结直肠癌生物特性的重要机制之一。
     

人类新血小板反应素R-spondin 3的细胞定位及其对肿瘤细胞功能的影响

目的观察人类新血小板反应素R-spondin 3(Rspo 3)的细胞定位,并探讨其在肿瘤发生发展中的可能作用。方法利用荧光显微成像法观察EGFP-Rspo 3在HEK293细胞中的分布。将重组质粒pcDNA-Rspo 3转染结肠癌细胞HT-29、LoVo,采用流式细胞术观察Rspo 3基因过表达对肿瘤细胞周期与凋亡的影响;采用Matrigel、Transwell实验分别检测Rspo 3基因过表达对肿瘤细胞黏附及侵袭能力的影响。结果荧光显微成像法观察发现,EGFP-Rspo 3融合蛋白在细胞核表达,呈弥散点状分布。流式细胞术观察发现,Rspo 3基因过表达对肿瘤细胞生长周期没有明显影响;Rspo 3基因过表达不影响低恶性的HT-29细胞凋亡,但诱导高恶性的LoVo细胞凋亡(P<0.01)。Rspo 3基因过表达增强肿瘤细胞黏附性(P<0.01),降低肿瘤细胞的侵袭力(P<0.01),对肿瘤细胞移行有一定抑制作用。结论 Rspo 3有核定位功能,能诱导部分肿瘤细胞凋亡并抑制其转移扩散。     

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附和运动能力的影响

 目的   探讨单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1［mono(ADP ribosyl)transferase-1,ART1］基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附、运动和侵袭能力的影响及其机制。方法   以携带ART1-shRNA的慢病毒感染小鼠结肠癌CT26细胞。将细胞分为实验组(感染ART1-shRNA慢病毒的CT26细胞),NC-shRNA对照组［感染阴性对照慢病毒(negative-control-shRNA,NC-shRNA) CT26细胞］及未处理组(未经处理的CT26细胞);RT-PCR 检测CT26细胞ART1 mRNA 表达变化,Western blot检测ART1、RhoA、integrinβ1蛋白表达的变化;用细胞基质黏附、运动和侵袭实验观察ART1-shRNA对CT26细胞基质黏附、运动和侵袭能力的影响。结果  获得稳定沉默ART1基因的CT26细胞株;RT PCR和Western blot结果均显示,实验组ART1 mRNA和ART1蛋白表达显著低于对照组(P<0.01);Western blot结果显示实验组RhoA、integrinβ1表达均显著低于对照组(P<0.01);实验组细胞黏附、运动、侵袭抑制率分别为70.72%,52.20%和60.00%。结论  单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1 (ART1)基因沉默可降低CT26细胞的黏附、运动、侵袭能力,该作用可能与ART1沉默后下调RhoA和integrin β1活性有关。     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株,观察Fas基因在转导前后的表达。方法采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间,以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo,用G418筛选克隆细胞。以dot blotting,Western blotting检测转导细胞Fas基因的表达。结果成功建立了Fas基因表达株。转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢,但无显著性差异,在Fas抗体作用下,转导株细胞生长明显受到抑制,有非常显著性差异。结论Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体介导,Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达。Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

内分泌腺性血管内皮生长因子对结肠癌LoVo细胞增殖和迁移的促进作用

目的：探讨内分泌腺性血管内皮生长因子（EG-VEGF）对结肠癌LoVo细胞相关恶性行为的影响。方法：采用不同浓度（50、100、200μg·L^-1） EG-VEGF处理的结肠癌LoVo细胞作为EG-VEGF组,采用不含EG-VEGF培养液培养的结肠癌LoVo细胞作为对照组。MTT法检测各组LoVo细胞的增殖活性,流式细胞术（FCM）检测各细胞周期LoVo细胞百分率,细胞划痕实验检测各组结肠癌LoVo细胞迁移率,Transwell实验检测各组结肠癌LoVo细胞迁移数。结果：MTT法,与对照组比较,50、100和200μg·L^-1EG-VEGF组LoVo细胞增殖活性明显升高（P<0.05）,且随着浓度的升高细胞增殖活性升高。FCM检测,与对照组比较,100μg·L^-1EG-VEGF组G₀/G₁期LoVo细胞百分率降低（P<0.05）,S期细胞百分率升高（P<0.05）,G₂+M期细胞百分率变化不明显。细胞划痕实验,100μg·L^-1EG-VEGF组LoVo细胞迁移率较对照组明显升高（P<0.05）。Transwell实验,50、100和200μg·L^-1EG-VEGF组结肠癌LoVo细胞迁移数较对照组明显升高（P<0.05）。结论：EG-VEGF可明显促进结肠癌LoVo细胞增殖和迁移,EG-VEGF可能与结肠癌的恶性发展有关联。     

α5β1整合素在大肠癌中的表达与大肠癌细胞生物行为学的关系

OBJECTIVE: To study the correlation between the expression of integrin alpha5beta1 in colorectal carcinomas and the differentiation and metastasis of the tumor cells. METHODS: The expression levels of integrin alpha5beta1 were detected immunohistochemically in 81 pairs of cancerous and non-cancerous tissues of patients with colorectal cancer. RESULTS: The expression of integrin alpha5beta1 was significantly higher in the samples of colorectal carcinomas, than in non-cancerous tissues (P<0.05). Lower expression levels were detected in moderately or well differentiated colorectal carcinomas than in poorly differentiated ones (P<0.05). No significant relation was noted between the expression of integrin alpha5beta1 and lymph node metastasis of the colorectal carcinomas (P>0.05). CONCLUSION: Alpha5beta1 expression is significantly associated with the carcinogenesis and differentiation of colorectal carcinomas, but not with their lymph node metastasis, and the expression level might be used as a valuable pathological indicator for the carcinogenesis and progression of colorectal carcinomas.     

RNA干扰技术沉默MDR1基因逆转大肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu的耐药性

目的  探讨多药耐药（MDR1）基因沉默对大肠癌耐药细胞系LoVo/5-Fu耐药性的逆转作用。方法  构建靶向MDR1的短发夹RNA(EASY-shRNA-MDR1)干扰质粒转染LoVo/5 Fu,实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）在mRNA水平检测抑制效果,噻唑蓝（MTT）法检测细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果  与未转染组相比,EASY-shRNA-MDR1组细胞MDR1mRNA表达明显下调（P<0.05）;细胞对5-Fu的IC50及RI显著降低（P<0.05）,敏感性的相对逆转率为74.7%;凋亡率明显升高(P<0.05)。结论  EASY-shRNA-MDR1可有效抑制大肠癌耐药细胞中MDR1的表达,进而降低了大肠癌耐药株对5-Fu的耐药性。     

羟基喜树碱对结肠癌LoVo细胞凋亡及 bcl-2、p53基因表达的影响

目的 探讨羟基喜树碱治疗结肠癌LoVo细胞的作用机制。方法 应用四唑盐比色试验、琼脂糖凝胶电泳、DNA末端原位标记染色法研究羟基喜树碱对结肠癌LoVo细胞生长及诱导凋亡的作用，采用Western Blot法分析羟基喜树碱处理结肠癌细胞前后bcl-2、p53基因的表达情况。羟基喜树碱对结肠癌LoVo细胞生长具有较强的抑制作用，可诱导结肠癌细胞凋亡，且其凋亡一浓度及时间依赖性。羟基喜树碱处理结肠癌LoVo细胞后，bcl-2基因表达下降，p53基因表达上升。结论 羟基喜树碱可诱导结肠癌细胞凋亡，可能与下凋bcl-2基因及升高p53基因表达有关。     

Smo siRNA对LoVO细胞Smo基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究Smoothened (Smo)小干扰RNA(siRNA)对结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,以及LoVo细胞增殖与凋亡的影响.方法 设计针对目标基因的siRNA.阳性脂质体介导转染LoVo细胞,半定量RT-PCR检测转染后LoVo细胞的Smo mRNA水平,MTT法和流式细胞术检测转染后LoVo细胞的增殖水平及细胞凋亡率.结果 siRNA-1、siRNA-2均能抑制LoVo细胞Smo基因的表达,siRNA-1抑制作用最明显,达63.56%,siRNA-2抑制作用为46.54%,两组与隐性对照组相比.差异均具有显著性.siRNA-1转染LoVo细胞后,细胞增殖水平较隐性对照组显著降低(P＜0.05);转染48 h后,细胞凋亡率较隐性对照组显著升高(P＜0.05).结论 Smo siRNA能有效地抑制结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,可以降低LoVo细胞的增殖水平,诱导细胞的凋亡.     

Fas转导大肠癌细胞诱导其凋亡的实验研究

目的：观察Fas转导大肠癌细胞株诱导大肠癌细胞凋亡效应，可望为进一步研究大肠癌的Fas基因治疗提供实验依据。方法：以流式细胞术(FCM)及琼脂糖凝胶电泳法捡测Fas转导大肠癌细胞调亡效应。实验分四组：a.LoVo细胞组b．LoVo细胞 Fas抗体组c.LOVo转导细胞组dLoVo转导细胞 Fas抗体组。结果：Fas转导大肠癌细胞株 Fas抗体组(d)细胞凋亡率明显高于a,b,c组。结论：Fas表达细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径。