反义技术及其抗病毒作用

反义技术(antisensetechnique)是指根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术[1]。包括反义RNA(asRNA)、反义寡聚核苷酸(asON)和具有核酸特异性切割活性的核酶(ribozyme)等。近年来的研究表明,反义?..     

反义技术在体外净化中的应用

随着分子生物学的迅速发展 ,以基因治疗为主的新技术、新方法被广泛地引入自体造血干细胞移植物的体外净化。笔者介绍反义技术在体外净化中的一些研究进展。1　反义技术用于体外净化的作用原理大多数肿瘤是异常基因表达、正常基因表达下调或过度表达的结果。反义核酸的策略是将与癌基因或异常表达的正常基因互补的反义核苷酸 (DNA或 RNA)导入肿瘤细胞 ,与肿瘤细胞内相应的 DNA或 RNA结合 ,阻断癌基因转录和表达 ,从而阻止肿瘤细胞生长。例如 ,大多数慢性粒细胞白血病 (CML)患者存在有染色体易位 ,并表达为具有 CML 特异性的 bcr/abl…     

反义寡核苷酸治疗白血病的研究现状

反义核酸技术是近十年来肿瘤治疗研究的热点,它包括反义寡核苷酸(又称反义DNA,Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)、反义RNA、核酶及RNA干扰等技术.其中反义寡核苷酸技术的主要作用原理是根据碱基互补配对原则,利用合成的寡核苷酸选择性地与靶基因mRNA互补结合,干扰或阻止其基因产物的形成,从而达到治疗肿瘤的目的.     

反义核酸技术及其在卵巢恶性肿瘤治疗中的应用

随着分子生物学及基因工程的发展 ,基因治疗已成为研究热点。反义核酸技术的概念是根据碱基互补原理 ,使用与目标靶的遗传物质 (DNA或mRNA)特定互补的短核苷酸片段封闭基因表达的方法。由于反义核酸技术是从生命的最根本点核酸角度着眼 ,对疾病的治疗有突破性的进展。1　反义核     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

反义寡核苷酸技术的进展及应用

随着分子生物学和遗传工程的发展,基因治疗应运而生,得到广泛的肯定,其中包括反义核酸技术,简称反义技术.那些能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合,并阻止其转录和翻译的短核酸片段,称为反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide).研究反义寡核苷酸作用机理和应用的技术叫反义技术.     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体的构建与鉴定

目的以真核表达载体单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)质粒型载体(pHSV)作为表达载体,构建大鼠MeCP2基因反义表达载体.方法用PCR方法扩增出大鼠MeCP2 cDNA部分片段,将其反向插入表达载体pHSV,并以PCR、酶切电泳以及DNA测序等方法对重组质粒进行鉴定.结果经过PCR、酶切电泳以及DNA测序,鉴定出连接方向和插入序列正确的反义表达载体.结论成功构建了大鼠MeCP2基因HSV-1型反义表达载体,为进一步研究该基因的功能打下了基础.     

反义治疗给药途径

反义寡核苷酸、核酶和DNA酶是一种新型的高选择性的基因表达抑制剂或调节剂.过去几年中这种治疗已经应用于治疗遗传缺陷.第一个反义寡核苷酸分子已在欧洲和美国批准用于临床.然而反义寡核苷酸的成功应用还需要不断完善细胞靶标和细胞内给药途径.     

反义技术在心血管病方面的应用

反义（antisense）核酸是指与体内某些RNA或DNA序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。通过反斗核酸特异性抑制某些基因的表达，可能抑制由于癌基因的表达引起的血管平滑肌细胞增殖，抑制某些心血管病的发生与发展。近年来该领域的研究结果显示：应用反义核酸技术抑制血管平滑肌细胞的增殖将可能成为治疗心血管疾病的新途径之一。     

反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药逆转的实验研究

目的　探讨反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法　以mdr1cDNA -9— 6为靶位点 ,合成反义核酸 (ATCCATCCCGACCTC)并用正义链作为对照 (GAGGTCGGGATGGAT) ,通过脂质体将其导入肺腺癌细胞A5 49/R ,分别采用逆转录聚合酶链反应、流式细胞仪、罗丹明试验及药敏试验观察两组细胞的mdr1mRNA、P糖蛋白 (Pgp)表达、罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性。结果　反义核酸处理的细胞mdr1mRNA下降 5 1 2 % ,正义组细胞和对照组细胞无明显变化、反义组细胞Pgp含量明显降低 ,细胞内罗丹明聚集 ,反义组 ,正义组和对照组的阿霉素IC50 分别为 0 0 0 9μg/ml、0 17μg/ml和 0 18μg/ml。 结论　反义核酸具有逆转人肺腺癌多药耐药的作用 ,其作用水平在mRNA或DNA水平 ,使Pgp的表达受到明显抑制 ,对阿霉素的敏感性明显提高。     

逆转录病毒载体介导HBV前C/C反义RNA的体外抗HBV作用

目的：了解反义乙型肝炎病毒(HBV)基因转移、表达的抗HBV作用。方法：BamH Ⅰ酶切HBV质粒获取1504bp前C／C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR构建了正、反义前C／C重组体。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，G418筛选获取抗性细胞及假逆转录病毒。RT-PCR检测了反义HBV基因表达的反义RNA。将重组假逆转录病毒感染2．2．15细胞，ELISA及斑点杂交法分别检测被感染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA。结果：反义前C／C重组逆转录病毒载体在细胞内能转录HBV反义RNA。反义前C／C重组假病毒感染的2．2．15细胞HBsAg、HBEAg的合成分别降低了55．5％、78％；HBV DNA水平也明显低于空白对照组。该抑制具有一定特异性。增加假病毒感染次数在一定范围内能提高抑制作用。正义假逆转录病毒感染对2．2．15细胞HBV DNA水平及抗原合成无影响。结论：逆转录病毒载体介导反义HBV基因转移表达的反义RNA能抑制HBV复制及抗原合成，具有潜在应用价值。     

反义PCNA与反义bcl-2脱氧寡核苷酸抑制人视网膜色素上皮生长

目的　观察反义增生细胞核抗原 (PCNA)和反义 bcl-2脱氧寡核苷酸对培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPE)生长的作用 .方法　用 DNA合成仪合成有 1 8个核苷酸的反义PCNA和 1 5个核苷酸的反义 bcl- 2脱氧寡核苷酸片段 ,以不同浓度加入 RPE培养液 ,培养 2～ 4d,用 SABC法检测细胞PCNA和 bcl- 2的表达 ,用 MTT法及流式细胞仪测定细胞抑制率 .结果　 6 .2 5～ 1 0 0μm ol· L- 1 的反义 PCNA对 RPE的抑制率为 8.3%～ 38.4% ,呈剂量依赖性 ,并抑制细胞 PCNA的表达 .反义 bcl- 2未显示抑制作用 .结论　反义 PCNA脱氧寡核苷酸可抑制近 40 %的 RPE生长 ,其临床应用值得进一步研究     

反义技术在造血系统疾病研究中的应用

<正> 反义技术是根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体生成的与目标靶的DNA或RNA序列特定互补的短核苷酸片段,抑制或封闭基因表达的技术方法。反义技术能够较好地抑制和封闭目的基因的表达,干扰复制、转录和翻译,为肿瘤的基因治疗和基因功能的研究提供了强有力的工具。1978年,Zamecnik和Stephenson首次发现反义RNA能抑制Rous肉瘤病毒在培养细胞中的增殖,展示了反义核酸作为基因水平治疗药物的潜力。1990年美国的基因工程新闻将反义技术列为9O年代十大热点生物技术之一。反义技术在临床应用方面取得了重大进展,目前已有4种反义     

白介素-1受体相关激酶-2和磷脂酰肌醇 3-激酶协同调控白介素-1诱导的NF-κB 活化

目的研究白介素1受体相关激酶2(IRAK-2)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI 3-激酶)在白介素-1(IL-1)诱导核因子- κB(NF-κB)活化中的作用.方法 Lipofectin介导反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸转染HepG2细胞后,用逆转录PCR法检测IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶 mRNA表达水平,以Sandwich ELISA法检测NF-κB的活化.结果 (1) 反义IRAK-2寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸分别抑制IRAK-2 mRNA和PI 3-激酶mRNA的表达;(2)反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸部分抑制NF-κB活化;(3)与反义IRAK-2寡核苷酸或反义PI 3-激酶寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比,反义IRAK-2 寡核苷酸和反义PI 3-激酶寡核苷酸共转染HepG2细胞对NF-κB的抑制作用明显增强.结论在HepG2细胞中,IRAK-2和PI 3-激酶都调控NF-κB活化但都不能完全激活NF-κB,IRAK-2和PI 3-激酶在调控NF-κB 活化时有协同作用.     

脂质体包裹DNMT1反义寡核苷酸诱导白血病细胞株孕酮受体去甲基化的实验研究

目的研究脂质体包裹DNA甲基转移酶(DNMT1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体(Progesterone Receptor，PR)启动子甲基化及表达的影响，探讨甲基化基因治疗的新途径。方法人工合成的DNMT1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白血病细胞株，用RT-PCR检测DNMT1、PRBmRNA表达的变化以及用MSP分析PRA、PRB甲基化状态的改变。结果用MG88转染白血病细胞株后，DNMT1 mRNA显著下降；PRA、PRB启动子出现脱甲基化，PRB mRNA表达显著上升。结论DNMT1反义寡核苷酸MC88可以诱导白血病细胞PR脱甲基化，使PRB mRNA表达升高，为DNA甲基化基因治疗的实验性研究提供了可能。     

转铁蛋白受体介导的Survivin反义RNA基因转移系统的构建及体外效应研究

目的:构建转铁蛋白受体介导的Survivin反义RNA基因转移系统并观察其对肝癌细胞的体外杀伤效应及凋亡检测。方法:用EDC法制备抗转铁蛋白受体与多聚左旋赖氨酸(PLL)的复合物并用分子筛层析纯化。根据DNA阻滞实验结果Survivin反义RNA重组质粒与Ab-PLL按1:3混合使二者结合形成Ab-pLL-Survivin反义RNA(质粒DNA)复合物,将此复合物转染人肝癌细胞株HepG2细胞观察其对HepG2细胞的杀伤效应及细胞凋亡的影响。结果:转染复合物组HepG2细胞的增殖受抑制、凋亡明显增多。结论:本基因体系具有很好的靶向性及杀伤、促凋亡效应。     

质粒pcDNA3.1-asHpa的构建及意义

目的 :构建乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 ,探索恶性肿瘤基因治疗的新途径。方法 :以质粒 pc DNA3.1为载体 ,将乙酰肝素酶信号密码的 DNA片段反向插入其多克隆位点得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体 ( pc DNA3.1 - as Hpa)。结果 :经过 PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因的大小和插入方向正确。结论 :成功的构建了乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 ,可以进一步用于反义基因表达的实验研究