骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

本实验观察了骨髓基质细胞(BMSCs)经化学诱导向神经细胞分化的过程,并初步探索其分化机制。首先分离培养扩增纯化SD大鼠BMSCs,应用β-巯基乙醇(BME)对第4代BMSCs进行诱导分化,分化稳定后撤除诱导液继续常规培养2周。结果显示:诱导分化前,细胞呈现梭形,平行排列生长。诱导分化后,多数BMSCs伸出突起,并发出初级和次级分支,相互交织成网状结构,成典型的神经元样细胞形态,分化过程中有部分细胞漂浮死亡。撤除诱导液常规培养2周后,分化的细胞逐渐缓慢恢复到原来成纤维细胞样长梭状形态。透射电镜观察到分化后细胞具有发育早期神经元的超微结构特点,免疫组织化学方法证实,神经干细胞标志蛋白(Nestin)在诱导分化后即开始表达,1h达到高峰,此时Nestin阳性细胞率为(29.35±1.45)%,之后随时间逐渐下降,5h时降至很低;神经元细胞标志蛋白-神经元特异性烯醇化酶(NSE)在诱导分化前不表达,在诱导分化后随时间表达逐渐增强,5h时阳性细胞率最高为(57.53±2.63)%;撤除诱导液常规培养2周时,Nestin、NSE表达均为阴性。星形胶质细胞标志蛋白-胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein GFAP)测定在不同组、不同时间点均为阴性结果。提示,BMSCs体外经BME化学诱导可向神经元样细胞分化,不能分化为胶质细胞;分化机制可能是先分化为神经干细胞,再转分化为神经元样细胞,这一化学分化过程是迅速、短暂、可逆的,且对细胞有损伤,因此,化学诱导后的BMSCs不适宜做细胞疗法的种子细胞。     

初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞中的作用

目的:研究初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法:全骨髓贴壁法分离、培养、纯化MSCs.含15 μmol/L白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫印迹检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.免疫荧光法检测MSCs增殖情况.扫描电子显微镜检测MSCs表面初级纤毛,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-Tu)的表达.结果:白藜芦醇诱导后60％的细胞胞体收缩,立体感增强,类似神经元.免疫印迹显示MSCs及对照组细胞有NSE蛋白的轻度表达,诱导后NSE、MAP-2蛋白表达阳性,随着诱导时间延长,NSE、MAP-2的表达渐增强.经过24 h饥饿后,90％的MSCs处于生长静止状态.扫描电子显微镜及免疫荧光显示,处于生长静止期的MSCs具有初级纤毛,且白藜芦醇可诱导具有初级纤毛的MSCs分化为神经元样细胞.对照组则无明显变化.结论:白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞.在此过程中,初级纤毛可能发挥着重要作用.     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的用川芎嗪(ligustrazin hydrochloride)在体外定向诱导SD青年鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，rMSCs)分化为神经元样细胞。方法用低糖DMEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，接种在塑料培养瓶中。经体外扩增、纯化，选用第5代后的骨髓间质干细胞进行诱导分化。用10μg／LbFcF预诱导24h，更换成含川芎嗪的无血清培养基DMEM诱导间质干细胞分化为神经元样细胞。用免疫组织化学SABC法鉴定神经丝蛋白(NF—M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果第5代间质干细胞形态达到均一，呈梭形。用川芎嗪诱导15min到3h，间质干细胞胞体逐渐增大，并伸出细长突起形似神经元样细胞。免疫组织化学显示NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43表达阳性，而GFAP阴性。对照组上述染色均为阴性。结论川芎嗪可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

损伤脊髓组织液对大鼠骨髓基质细胞向神经细胞诱导分化的研究

目要：探讨成年大鼠骨髓基质细胞在损伤脊髓组织液中向神经细胞分化的可能性，为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法。方法：从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第5代，将正常、伤后1d，伤后1周及伤后3周脊髓提取液加入细胞培养基中，观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NSE特异性标志物。结果：加入脊髓提取液诱导后24h，部分细胞的形态已发生改变，48h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征，而目NSE等特异性抗体呈阳性表达。结论：损伤脊髓组织液能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞。     

NGF对小鼠骨髓基质细胞体外诱导分化作用

为观察NGF等对小鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用,从小鼠骨髓中分离培养基质细胞并传至第3代,采用bFGF预诱导24 h,NGF、维甲酸、β-巯基乙醇等诱导24 h后,进行NF-200、GFAP、fibronectin免疫荧光染色,荧光显微镜观察免疫阳性细胞。结果表明:诱导后小鼠骨髓基质细胞形态改变不明显,但出现表达NF-200、GFAP的细胞,而表达fibronectin的细胞减少,对照组几乎无NF-200和GFAP免疫阳性细胞,主要为表达fibronectin细胞。结论:NGF等可以在体外诱导小鼠骨髓基质细胞分化成表达NF-200和GFAP细胞。     

骨髓基质细胞对脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的：观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导的新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法：采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法，通过显微镜观察神经干细胞的分化状态，使用免疫组织化学技术，分析神经元在神经细胞后代中所占的比例。结果：（1）骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元；（2）骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论：骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

丹参诱导骨髓基质细胞神经元样细胞分化的microRNA-128路径

目的　研究microRNA-128在丹参制剂诱导大鼠骨髓基质细胞(bone marrow strowal cells,BMSCs)向神经元样细胞分化过程中的调控作用。  方法　培养鉴定大鼠BMSCs,应用反义寡居核苷酸转染技术（Lipofectamin 2000）转染microRNA-128 inhibitors于BMSCs;取转染和未转染的BMSCs,待细胞增殖到60%~70%融合时进行预诱导分化,预诱导24 h后,进行诱导分化;根据处理方式不同分为4组：未诱导组（A组）,丹参制剂诱导组（B组）,转染未诱导组（C组）,转染诱导组（D组）。流式细胞术鉴定BMSCs;qPCR检测microRNA-128及神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（Nestin）、微管蛋白（β3-tubulin）的mRNA表达;Western blot检测NSE、Nestin和β3-tubulin的蛋白表达。  结果    BMSCs流式细胞检测CD29和CD90双阳性率达99.17%,CD11b和CD45双阴性率达99.21%;丹参制剂诱导及microRNA-128 inhibitors转染后,细胞microRNA-128表达量显著降低（P<0.05）;诱导与未诱导组,转染与未转染组比较,NSE、Nestin和β3-tubulin的mRNA和蛋白表达均显著升高（P<0.05）。  结论　丹参制剂能够抑制BMSCs的microRNA-128表达,进而影响BMSCs神经分化相关蛋白的表达,促进BMSCs向神经元样细胞分化。     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

骨髓基质细胞促进人胚神经干细胞向神经元的分化

目的:探讨骨髓基质细胞(BMSCs)对人胚神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用机械法分离人胚NSCs,成球法进行传代培养,采用免疫荧光染色检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达鉴定NSCs。按培养方式不同,分为NSCs自然分化组、BMSCs和NSCs直接接触共培养组及Transwell共培养组,采用免疫细胞荧光法及免疫印迹法检测各组神经元和星形胶质细胞标志物的表达。结果:在直接接触共培养组和transwell共培养组中,免疫荧光染色显示神经元标志物NSE阳性细胞率明显高于自然分化组,而星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞率低于自然分化组。免疫印迹检测显示Transwell共培养组中NSE表达量显著高于自然分化组,而GFAP表达量低于自然分化组。结论:BMSCs具有促进NSCs向神经元分化的作用。     

骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质细胞(BMSCs)在诱导剂的作用下在体外可以定向分化为神经元样细胞,但尚未在临床上广泛使用,主要的原因是神经元样细胞的数量和纯度不够。在骨髓基质细胞诱导分化为神经元样细胞的研究中,诱导剂的选择是关键,目前常见的诱导剂有β-巯基乙醇、细胞因子等。近年来发现利用中药也可以进行诱导分化。     

体外诱导恒河猴骨髓基质细胞分化为神经细胞的分化条件

目的比较血清维甲酸(retinoic acid,RA)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)等在不同浓度诱导条件下使恒河猴骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)诱导分化为神经干细胞(NSCs)及成熟神经细胞的分化条件。方法用Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色,鉴定NSCs;用NSE、β-tublin鉴定神经元;用GFAP鉴定神经胶质细胞,膜片钳检测分化成熟细胞的电生理特性。结果培养第8天多数细胞表现出Nestin及CD133抗原阳性,即为NSCs细胞;诱导后3天即有神经元样细胞出现,此后神经元样细胞逐渐增多,膜片钳检测发现这些细胞具有类似神经细胞的电生理特性。同时,与其他培养条件相比较,低浓度血清(2．5％) RA GDNF组诱导分化效能最高。结论应用RA GDNF及配合使用低浓度血清能够高效诱导骨髓源NSCs向成熟神经细胞分化。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

Bone marrow stromal cells induce cell cycle arrest in reactive astrocytes in vitro

Transplantation of bone marrow stromal cells (BMSCs) reduces astrogliosis, decreases scar thickness and improves neurological functional recovery after brain damage. It is believed that transplanted BMSCs have a profound influence on astrocytes. To obtain the possible mechanism in their interaction, a co-culture system between BMSCs and astrocytes were set to investigate whether BMSCs could modulate cell cycle machinery in reactive astrocytes. The results obtained showed cell cycle regulatory proteins, cdk4 along with its activator cyclin D1, and PCNA increased while p27, an endogenous cyclin-dependent kinase inhibitor, deceased in glutamate-treated astrocytes in vitro. However, BMSCs influenced cell cycle elements in the cocultured astrocytes: cyclin D1, cdk 4 and PCNA were downregulated, while p27 was unregulated. Flow cytometry showed astrocytes in the S phase after glutamate incubation increased to 17.4 ± 2.0% while restored to a level of 7.8 ± 1.1% when cocultured with BMSCs. l-Canavanine, an inhibitor of inducible nitric oxide synthase, partially reversed the S phase to 11.3 ± 0.4% in the cocultured astrocytes. These data indicated that BMSCs might inhibit the cell cycle control system in reactive astrocytes and nitric oxide signaling was involved in this process. The decline of astrogliosis conferred by BMSCs may derive from their effect of inhibiting the cell cycle progression in astrocytes.     

骨组织工程的种子细胞--骨髓基质细胞的研究进展

骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞具有广阔前景.许多实验证实骨髓基质细胞具有间充质干细胞特性,表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能.目前已建立了体外培养骨髓基质干细胞的方法,而且正在摸索进一步纯化的方法和诱导分化的条件.已有利用其成骨特性体内移植实验,表明在适当的条件下,接种在组织工程材料上的骨髓基质细胞可以形成新骨.     

bFGF对大鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用

目的 观察bFGF对大鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用。方法 从大鼠骨髓中分离培养基质细胞并传至第3代，用含10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的诱导培养基诱导，然后观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法检测诱导后24h、48h、72h、96h细胞神经丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果 诱导后24h的部分细胞不仅在形态上表现为神经元样，而且呈NF-200阳性表达，GFAP阴性。48h、72h、96h NF-200阳性细胞数与24h间无显著性差异(P＞0．05)。结论bFGF可以在体外诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化。     

GFP基因转染对骨髓基质细胞体内向软骨细胞分化的示踪作用

目的 :实现绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)报告基因在骨髓基质细胞 (BMSC)中的高效、稳定、持久表达 ,直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法 :构建重组逆转录病毒表达载体RV GFP ,通过PT6 7包装细胞克隆、G4 18筛选及扩增 ,获得大量含GFP基因的假病毒液 ,并直接转染BMSC。将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后 ,植入猪自体关节软骨缺损处 ,7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化。结果 :经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV GFP构建成功 ,转染PT6 7细胞后可在荧光激发波长下 ,发出明亮的绿色荧光 ,转染率达 2 0 %～ 5 0 % ,经G4 18筛选后可达 10 0 %。筛选、扩增后 ,PT6 7细胞的上清培养液可成功地转染BMSC ,筛选后能稳定、持久、高效表达GFP。将标记的BMSC植入关节软骨缺损 7个月后 ,修复组织仍能高效表达GFP ,激光共聚焦显微镜下显示 ,多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论 :构建的重组逆转录病毒GFP载体 ,能持久标记骨髓基质细胞 ,用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪 ,该方法简便、灵敏、可靠、直观。标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞 ,并在软骨缺损的修复中发挥重要作用