Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达的调节

目的：探查伤寒沙门菌hfq基因在高渗应激早期对其他基因表达的影响。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较伤寒沙门菌野生株和咆向基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果：伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。实时定量PCR结果与芯片分析一致。结论：Hfq作为一个调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

mig-14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用.方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证.结果:成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调. 结论:mig-14可能是一种调节基因,主要参与调节细菌的物质和能量代谢.     

PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行RT-RCR验证.结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22 个基因表达下调.结论:PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用.     

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

LuxS/AI-2对伤寒沙门菌基因表达的调节

目的:探讨伤寒沙门菌luxS基因在葡萄糖存在下对细菌对数生长中期基因表达调控的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌luxS基因缺陷变异株;比较野生株与缺陷株的生长情况及动力差异;用哈氏弧菌BB170作为报告菌株检测不同时期野生株与缺陷株的生物发光;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较在葡萄糖存在下伤...     

Fis对伤寒沙门菌基因表达的系统调节作用

目的：探讨伤寒沙门菌调节因子fis对基因表达的系统调节作用。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株,用脉冲场凝胶电泳分析fis缺陷变异株的基因组结构。利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株的基因表达谱差异。用重组载体pBADfis回补fis缺陷变异株,选择部分差异表达基因进行qRT—PCR验证,用半固体平板培养观察野生株、fis缺陷变异株和回补株的动力。结果：fis基因缺陷变异株含有二相鞭毛素编码基因的线性质粒缺失,且动力消失;基因表达谱比较分析结果表明,伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株在对数生长期94个基因出现表达差异;qRT—PCR分析所选基因表达的结果与芯片分析结果相符;fis缺陷变异株在回补fis基因后,动力及差异表达基因都获得明显恢复。结论：Fis在伤寒沙门菌中对动力、侵袭及多种代谢相关基因的表达发挥重要调节作用。     

OxyR蛋白对不同应激条件下伤寒沙门菌生存能力的影响

目的：研究OxyR蛋白对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.Typhi)在应激条件下生存能力的影响。方法：用λ-Red系统制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株;通过重组质粒pBAD/gⅢ将oxyR基因和pBAD/gⅢ空质粒分别导入oxyR基因缺陷变异株;构建oxyR缺陷回补株和oxyR缺陷回补空质粒株;制作生长曲线,观察野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回补株及oxyR缺陷回补空质粒株在不同应激条件下的生长状况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析OxyR对S.Typhi氧化调节相关基因表达的影响。结果：成功制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株、oxyR基因缺陷回补株和空质粒对照株;生长能力分析结果表明,与野生株相比,oxyR缺陷株在氧应激时生长缓慢(P<0.05),oxyR缺陷回补株的生长能力得到恢复;qRT-PCR结果显示,在氧应激时OxyR蛋白可以抑制hemH基因的表达,活化uxuA基因的表达。结论：OxyR蛋白参与S.Typhi对氧应激的调节,为进一步研究S.Typhi 的致病性奠定了基础。     

H:z66抗体应激后伤寒沙门菌fliG基因缺陷株与野生株基因表达的差异

目的:观察伤寒沙门菌鞭毛转子蛋白基因fliG在H:z66抗体应激后对其他基因表达的影响。方法:利用自杀质粒介导的同源重组法制备伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后的基因表达谱差异,并选择部分表达有差异的基因进行实时定量PCR验证。结果:经PCR验证及序列比对,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较结果表明,与野生株相比,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后有21个基因表达上调,7个基因表达下调;实时定量PCR结果与芯片结果一致。结论:fliG基因在伤寒沙门菌受到H:z66抗体刺激后的基因表达调控中发挥一定作用。     

伤寒沙门菌fljA样基因表达载体的构建

目的：进一步明确二相伤寒沙门菌鞭毛抗原表达调节机制，系统分析伤寒沙门菌fljA样基因功能，构建含倒样基因的表达载体并验证其表达。方法：根据倒样基因两端序列设计引物，以z66抗原阳性伤寒沙门菌GIFU10007基因组为模板，通过PCR获得该基因，与表达载体pET22b连接后，重组体转化至大肠杆菌JM109中诱导培养，并通过RT-PCR观察傅4样基因表达情况。结果：基因克隆和序列分析结果显示伤寒沙门菌庳4样基因被成功导入载体pET22b，RT-PCR结果提示大肠杆菌JM109可利用此重组载体进行西4样基因表达。结论：成功获得能在大肠埃希菌中表达伤寒沙门菌西4样基因的载体。     

伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能.方法:用载体pBAD介导回补uhpA至伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株,用qRT-PCR观察cysM和treB基因表达,用表达载体pET-22b原核表达UhpA蛋白,用凝胶阻滞试验观察UhpA蛋白与cysM和treB启动子区域DNA片段的结合.结果:成功构建pBADuhpA重组质粒,在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因后,cysM和treB的表达明显恢复,但UhpA-His6蛋白与cysM和treB的启动子区域DNA片段无明显结合.结论:伤寒沙门菌UhpA在高渗应激条件下能促进硫代谢及海藻糖代谢相关基因表达,且可能为间接作用.     

伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备

目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株.方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶Bgl Ⅱ位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用Bgl Ⅱ消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段.将此片段胶回收后并导入自杀质粒pGMB151的BamH Ⅰ位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组.用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定.结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基.结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.     

SurA通过调控鞭毛表达影响伤寒沙门菌生物膜的形成

目的：研究周质伴侣蛋白SurA对伤寒沙门菌生物膜形成能力的影响及其潜在机制。方法：用前期构建的surA基因缺陷株、缺陷空载体株及缺陷回补株的生物膜实验,观察surA基因缺失对细菌生物膜形成能力的影响。通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测影响生物膜形成的几个关键基因在surA缺陷株及野生株中的表达差异,探索surA影响细菌生物膜形成的可能通路。通过电镜实验观察surA缺陷株及野生株的鞭毛表达情况。最后通过生物膜实验观察鞭毛缺失对生物膜形成的影响。结果：与野生株相比,surA缺陷株的生物膜形成能力显著下调,缺陷株里回补surA后,细菌的生物膜形成能力恢复到与野生株相当。与野生株相比,surA缺陷株中鞭毛相关基因的mRNA水平显著下调。电镜结果显示,与野生株相比,surA缺陷株的鞭毛表达数量显著减少。鞭毛缺失株(△flhD)几乎不形成生物膜。结论：伤寒沙门菌surA基因缺陷可能通过下调鞭毛基因表达来影响生物膜形成。     

伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌核糖核酸酶 G对胞内非编码RNA T3956水平的影响

目的: 研究伤寒沙门菌核糖核酸酶G（RNase G）对非编码RNA（ncRNA）T3956胞内水平的影响。方法: 利用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌RNase G基因（rng）缺陷变异株;利用重组质粒pBAD将rng导入rng缺陷变异株,构建rng缺陷回补株;通过实时定量PCR分别比较伤寒沙门菌野生株、rng缺陷变异株、回补株等在不同生长时期的ncRNA T3956水平。结果: 成功制备伤寒沙门菌rng缺陷变异株、rng缺陷回补株和空质粒对照株; 实时定量PCR结果表明,rng缺陷株中T3956的胞内水平较野生株有所升高,并且在对数中期和稳态期升高得更加明显,而回补株胞内T3956的水平又得到恢复。结论: 伤寒沙门菌RNase G能够参与对胞内ncRNA T3956水平的调控,并且在细菌对数生长中期和稳态期作用更为明显。     

伤寒沙门菌virK和mig-14基因在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的差异

目的： 比较伤寒沙门菌virK和mig-14基因在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的差异,探讨两者在拮抗多黏菌素B杀伤作用中的关系。方法： 用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌virK缺陷变异株和virK /mig-14双缺陷变异株,在弱酸性环境下对缺陷菌株做多黏菌素B杀伤试验,比较mig-14缺陷株、virK缺陷株和virK／mig-14双缺陷株对多黏菌素B的耐受情况。结果： 成功制备伤寒沙门菌virK缺陷变异株和virK /mig-14双缺陷变异株,在弱酸性环境下mig-14缺陷株、virK缺陷株和virK／mig-14双缺陷株对多黏菌素B的耐受情况基本一致。结论： virK在伤寒沙门菌GIFU10007中也发挥对多黏菌素B的拮抗作用,与mig-14对多黏菌素B的拮抗作用有相似效果。     

z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后染色体结构分析

目的 分析z66抗体诱导z66抗原阳性伤寒沙门菌鞭毛抗原表达改变后染色体结构。方法 利用脉冲凝胶电泳（PFGE）结合XbaI消化,对伤寒沙门菌标准菌株Ty2,z66抗原阳性株GIFU10007及z66抗体诱变j抗原阳性株GIFU10007-j的染色体DNA进行比较分析。结果 GIFU10007-j染色体DNA有两个XbaI片段与GIFU10007不同,总体染色体减少约250kb;与Ty2相比,GIFU10007染色体DNA有13个相同及7个不同的XbaI片段,总体染色体大小接近。结论 z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后的染色体DNA发生了局部结构缺损;伤寒沙门菌z66鞭毛抗原阳性及诱变阴性株与单相标准菌株Ty2间在染色体DNA结构上有明显差异。