膜型/分泌型MICA对NK细胞受体NKG2D的相反调节效应及其对NK细胞受体谱的影响

目的　观察膜型和分泌型MICA对NK细胞受体表达的影响 ,以探讨NK细胞抗肿瘤活化机制及肿瘤细胞表达MICA分子的意义。方法　用MTT法测定人NK细胞系 (NK92 )的细胞毒活性 ;用RT PCR或FACS检测NK细胞受体 (NKG2D ,NKG2A B ,KIR2DL1,KIR2DS1)及NKG2D的识别配体MICA的表达。结果　肿瘤细胞表面的MICA分子可上调NKG2D的表达 ,下调抑制性受体NKG2A B和KIR2DL1的表达 ;而分泌型MICA (sMICA)分子对NKG2D及抑制性受体的表达均有抑制作用。结论　膜型MICA分子可上调NKG2D的表达 ,激发NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应 ;分泌型MICA分子则通过降低NKG2D的表达下调机体的抗肿瘤免疫效应 ,肿瘤细胞分泌sMICA分子为肿瘤发生免疫逃逸的机制之一。     

外源性抗原对内皮细胞MHC-I类链相关基因A表达的影响

背景：研究表明部分肾移植受者在移植前就产生了MHC-I类链相关基因A(MICA)抗体,包括部分自身抗体,其急性排斥反应发生率明显高于抗体阴性者。 目的：探讨外源性抗原对内皮细胞MICA表达的影响。 方法：分别以5,10和25 μg/L 3个剂量,将MICA重组蛋白分为M5,M10,M25组,将热休克蛋白分为H5,H10,H25组,对人脐静脉内皮细胞予以诱导培养48 h,对照组加入等量的磷酸盐缓冲液。 结果与结论：用MICA重组蛋白诱导48 h后,各实验组(M5,M10,M25)内皮细胞MICA mRNA和MICA蛋白的表达量与对照组比较均有显著增加(P < 0.05)。M5组和M10组MICA mRNA和MICA蛋白均高于M25组   (P < 0.05) 。MICA膜蛋白表达以M10组最高,并与M5组、M25组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。各实验组(M5,M10,M25)可溶性MICA水平较对照组显著下降(P < 0.05)。热休克蛋白组内皮细胞MICA基因的表达和可溶性MICA水平均无明显改变。结果表明外源性MICA抗原能够诱导内皮细胞自身MICA mRNA和蛋白表达上调,尤其是细胞膜蛋白增加明显,但可溶性MICA水平显著下降。     

同种异体NK细胞对不同肿瘤细胞的体外杀伤活性及其机制的初步探讨

为了观察同种异体NK细胞对不同肿瘤细胞的体外杀伤活性,并初步探讨其分子机制。以K562细胞为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时同种异体NK细胞杀伤CNE2、KG1a和U251细胞的活性。应用RT-PCR和流式细胞仪分别检测4种细胞MHCI类链相关分子(MICA/B)和人巨细胞病毒糖蛋白UL16结合蛋白(ULBP1~3)基因和分子的表达情况。效靶比20∶1时用AMO-1、BMO-1、M295、M310和M551单抗分别阻断肿瘤细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化。结果:NK细胞对K562、CNE2和KG1a细胞均有杀伤活性,对U251细胞无杀伤活性。在mRNA水平4种细胞均表达MICA/B和ULBP1~3基因。K562细胞表达MICA/B和ULBP1~3全部分子;KG1a和U251细胞均不表达5种分子;CNE2细胞表达MICA/B和ULBP2,不表达ULBP1和ULBP3。CNE2、KG1a和U251细胞均高表达HLAI分子,而K562细胞不表达。用单抗分别阻断靶细胞表面相应的NKG2D配体分子,NK细胞对KG1a和U251细胞的杀伤活性无变化。NK细胞对K562和CNE2细胞的杀伤活性可部分被封闭。同种异体NK细胞在体外对不同肿瘤细胞的杀伤活性不同,其杀伤机制也不完全相同。     

三氧化二砷提高多发性骨髓瘤ARH-77细胞对NK细胞杀伤敏感性的研究

目的 研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)前后人多发性骨髓瘤ARH-77对NK细胞杀伤细胞敏感性的变化,并初步探讨其机制.方法 分别应用CCK-8法和台盼蓝染色法测算ATO对ARH-77细胞株的50%抑制量(IC50)和细胞活性;乳酸脱氢酶释放法检测ATO作用前后ARH-77细胞对NK细胞的杀伤敏感性.流式细胞仪检测ARH-77细胞表面NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3)和HLA-Ⅰ类分子表达以及ATO作用前后的细胞周期变化.结果 ATO对ARH-77细胞的IG50为5.0μmol/L.NK 细胞杀伤ATO作用前后ARH-77细胞的活性有显著差异(P＜0.05).ATO作用后,ARH-77细胞发生G1/S期阻滞,同时其表面MICA/B、ULBP1、ULBP3表达显著升高,二者之间差异有统计学意义(P＜0.05).ULBP2和HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P＞0.05).结论 ATO能提高ARH-77细胞NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULIBP3)表达;从而使其对NK细胞的杀伤敏感性增强.     

人脐静脉内皮细胞表达CD137分子及其功能的初步研究

目的　了解人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)CD137分子的表达情况 ,探讨其对内皮细胞功能的影响。方法　胰蛋白酶法分离培养人脐静脉内皮细胞 ,用RT PCR、定量荧光PCR和流式细胞仪技术 ,分别观测未刺激和用内毒素 (LPS)刺激的内皮细胞CD137mRNA与蛋白的表达情况。用anti CD137单克隆抗体交联内皮细胞表面CD137,ELISA检测其上清液中IL 8的含量。结果　①RT PCR和实时荧光定量RT PCR结果显示 ,未经刺激的人脐静脉内皮细胞表达少量CD137mRNA ,流式细胞仪检测证实其细胞表面表达少量CD137蛋白 ;当用LPS刺激内皮细胞培养 2 4h后 ,mRNA和蛋白表达量均显著提高。②ELISA检测发现 ,anti CD137单克隆抗体交联内皮细胞表面CD137分子后 ,和同型抗体对照组相比 ,其培养上清液中细胞因子IL 8的表达量明显提高 ,与LPS刺激内皮细胞上调IL 8表达的程度相当。结论　人脐静脉内皮细胞组成性表达少量CD137分子 ,LPS可以显著上调其表达。交联内皮细胞表面CD137分子可提高其IL 8产生和分泌 ,提示其具有刺激内皮细胞活化的生物功能     

MICA基因研究进展及与疾病的关系

MICA基因在人类位于6p HLA-Ⅰ类基因区HLA-B位点着丝粒端的46kb左右,其组成、表达和产物与HLA-Ⅰ类基因不同。该基因包含6个外显子,编码的蛋白分子结构域与经典的Ⅰ类分子α链相似,包括3个胞外结构域:α1、α2和α3,加上跨膜区和胞质区,不含β2m。MICA大量表达于上皮细胞和纤维母细胞的表面,在T、B细胞表面不表达,但在大多数上皮性肿瘤细胞表面都有表达。MICA分子与其配体NKG2D受体结合后可以激活NK细胞、Vδ1γδT细胞等,参与天然免疫应答。现已发现MICA与某些肿瘤和免疫相关性疾病(如白塞氏病、1型糖尿病)存在关联,并且在肿瘤和某些疾病的发展中起着重要作用。     

树突状细胞上调MHC Ⅰ类相关抗原A表达对NK细胞活性的影响

目的:观察单核细胞、未成熟和成熟树突状细胞(DCs)表达MHC Ⅰ类相关抗原A(MICA)的情况,以及DCs表达MICA后对NK细胞活性的影响.方法:用流式细胞术分别检测单核细胞、未成熟DC(iDCs)以及LPS、TNF-α、CD40L、IL-15和IFN-α分别刺激的成熟DCs表面MICA的表达,并观察DCs表达MICA后对NK细胞表达CD69、细胞毒活性和分泌IFN-γ的影响.最后用流式细胞术检测重组NKG2D/Fc蛋白和抗IL-12单克隆抗体(mAb)对DCs激活NK细胞的影响.结果:单核细胞不表达MICA,iDCs低表达MICA.LPS、TNF-α和CD40L对DCs表达MICA无影响;但IFN-α和IL-15可促进DC上调MICA表达.DCs表达MICA后可促进NK细胞表达CD69、分泌IFN-γ、杀伤K562细胞.NKG2D/Fe蛋白可抑制NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ;而抗IL-12mAb仅抑制IFN-γ分泌.结论:MICA在DCs表面的表达受局部微环境影响,且DCs表达MICA后可增强NK细胞的活性.     

IFN-α对宫颈癌细胞MHC-I类链相关蛋白A表达的上调作用

目的:观察IFNα对宫颈癌细胞MHCI类链相关蛋白A(MICA)表达及功能的影响。方法:以IFNα诱导宫颈癌细胞系HeLa和Caski后,用半定量RTPCR和免疫组化染色法观察诱导前后MICAmRNA和其蛋白表达的变化,用MTT比色法检测诱导前后宫颈癌细胞对外周血NK细胞杀伤敏感性的变化。结果:经IFNα诱导后,HeLa和Caski细胞中MICAmRNA和其表面MICA蛋白的表达水平均明显上调,并呈一定的时间和剂量依赖关系。NK细胞对MICA表达较高的HeLa细胞的杀伤活性,明显高于对MICA弱表达的Caski细胞。经1×106U/LIFNα诱导3d后,两种细胞对NK细胞杀伤的敏感性均明显增强(P<0.01)。结论:IFNα可上调MICA在肿瘤细胞表面的表达,并可增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。     

自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑血管内皮细胞 VCAM-1和MHCⅡ类分子表达

目的　探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)大鼠脑血管内皮细胞表面分子的改变。　方法　用免疫组织化学方法检测EAE大鼠脑血管内皮细胞上血管细胞粘附分子 1(VCAM 1)和主要组织相容性复合体 (MHC)Ⅱ类分子的表达。用MTT(四甲基偶氮唑盐 )法检测不同发病级别大鼠血清TNF和IFN γ的水平。　结果　EAE大鼠脑血管内皮细胞较对照有诱导表达的VCAM 1和MHCⅡ类分子 ,血清中存在TNF和IFN γ活性。　结论　中枢神经系统炎症状态下 ,脑血管内皮细胞表面分子发生改变 ,提示它们在EAE发病中可能起重要作用     

MICA分子在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用

目的 观察乳腺肿瘤细胞膜MHC Ⅰ链相关分子A(MHC class Ⅰ chain-related gene A,MICA)及血清中可溶性MICA表达,探讨MICA在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用.方法 流式细胞术检测膜型MICA(mMICA)及NK细胞表面NKG2D表达,观察膜型MICA、可溶性MICA(sMIcA)对NKG2D表达的影响;免疫组织化学检测膜型MICA及可溶性MICA的表达及分布;抗体封闭法观察膜型MICA与NKG2D相互作用.结果 乳腺细胞膜型MICA在正常组织不表达,在良性肿瘤表达量为(38.5±7.5)%,恶性肿瘤表达量为(53.2±5.6)%.可溶性MICA含量在健康成年人为阴性,在乳腺良性肿瘤患者血清中含量(76.8±22.3)pg/mL,在恶性肿瘤患者中含量(205.36±71.27)pg/mL.经NKG2D或MICA抗体封闭后,NK细胞的杀瘤活性显著减弱.含可溶性MICA的血清可明显下调NKG2D的表达.结论 大部分乳腺肿瘤细胞膜都有MICA的表达,可作为乳腺肿瘤相关性抗原.膜型MICA与NKG2D的相互识别在介导NK细胞抗乳腺癌中起重要作用,而可溶性MICA通过下调NKG2D表达介导肿瘤免疫逃逸.     

MHC-Ⅰ链相关基因A在免疫性疾病中的研究进展

MHC-Ⅰ链相关基因A（MICA）位于人第6号染色体的MHC—Ⅰ类区域中,该基因包含6个外显子,编码的蛋白分子结构域与经典的Ⅰ类分子α链相似,包括胞外结构域（α1、α2与α3）、跨膜区和胞质区,但不含β2微球蛋白。MICA表达于内皮细胞、上皮细胞、单核细胞、成纤维细胞以及大多数上皮性肿瘤细胞表面,但在CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞和CD19^＋细胞不表达。MICA在肾脏等器官移植排斥反应和移植物存活率有重要的相关性,其抗体阳性者预后较差。MICA在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病的发生、发展过程中起着独特的作用。     

NKG2D配体的表达直接影响NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤

目的:探讨NKG2D配体在不同发育阶段树突状细胞(DC)表面的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响.方法:用细胞因子(rh IL-4、rhGM-CSF、TNF-α)体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞(iDC)和成熟树突状细胞(mDC)并鉴定形态和表型,免疫磁珠法分离纯化NK细胞.流式细胞术(FCM)检测iDC和mDC表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3的表达.用LDH释放法检测NK细胞对iDC和mDC的杀伤活性以及抗NKG2D单克隆抗体(mAb)阻断NK细胞后的杀伤活性.结果:培养的iDC和mDC具有典型的细胞形态和免疫表型特征.iDC表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP3,表达率分别为(32.39±8.30)%、(17.75±3.40)%、(26.71±6.48)%、(38.37±6.89)%;mDC表面表达MICA 、ULBP3,表达率分别为(7.82±2.67)%、(8.36±2.42)%,比iDC表面相应配体表达率低(P<0.01).各效靶比NK细胞对iDC的杀伤活性均比对mDC的杀伤活性高,差异有统计学意义(P<0.01).抗NKG2D mAb阻断NK细胞后对iDC杀伤活性比阻断前减弱(P<0.05);对mDC的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(P>0.05).结论:NKG2D配体在iDC表面表达高,介导了NK细胞对iDC的杀伤,而对mDC的杀伤无影响,是NK细胞对iDC选择性高杀伤的分子机制之一.     

OX-LDL诱导内皮细胞条件培养液对内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的影响

目的探讨受损内皮细胞的自分泌和旁分泌对内皮细胞自身的影响。方法利用正常内皮细胞条件培养液和用氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导内皮细胞的条件培养液分别作用于正常内皮细胞和受损内皮细胞,用酶联免疫细胞化学法检测血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的变化。结果正常内皮细胞的条件培养液和OX-LDL诱导的内皮细胞条件培养液对正常内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达作用不明显(P>0.05),而对受损内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达具有明显的下调作用(P<0.01)。结论正常和受到氧化损伤的内皮细胞的自分泌和旁分泌作用对正常内皮细胞黏附分子没有影响,而对受损内皮细胞黏附分子有下调作用,说明内皮细胞可通过下调黏附分子的表达来实现自身的抗损伤作用。     

5-氟尿嘧啶增强HeLa细胞对自然杀伤细胞敏感性研究

目的 用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理HeLa细胞,检测其NKG2D 配体 MICA 的表达及其对NK92细胞杀伤敏感性的变化.方法 不同浓度的 5-FU处理 HeLa细胞,在不同时间点用半定量PCR及流式细胞术检测HeLa细胞表面的NKG2D配体MICA在RNA及蛋白水平的表达变化情况,用MTT法检测NKG2D抗体封闭NK92细胞的NKG2D受体前后, NK92 细胞对HeLa细胞的杀伤作用.结果 不同浓度的5-FU作用于 HeLa 细胞后,半定量RT-PCR结果显示MICA表达随5-FU作用浓度增加逐渐增高.而且40 μg/ml 5-FU作用于HeLa细胞后随着作用时间的延长(0、8、16、24 h)MICA表达增加,流式细胞术检测结果表明,MICA表达的增加主要依赖于未凋亡细胞的 MICA表达.在40μg/ml 5-FU作用24 h,效靶比为2.5∶ 1,5∶ 1,10∶ 1,20∶ 1时都检测到NK92细胞对HeLa细胞的杀伤增强,杀伤作用可部分被NKG2D抗体抑制.结论 5-FU 能够上调HeLa细胞表面NKG2D配体MICA的表达,增强HeLa细胞对NK92细胞的敏感性,提示化疗联合NK细胞免疫治疗宫颈癌可产生协同作用,提高治疗效果.     

MICA基因研究进展及与疾病的关系

MICA基因在人类位于6P HLA-Ⅰ类基因区HLA-B位点着丝粒端的46kb左右，其组成、表达和产物与HLA-Ⅰ类基因不同。该基因包含6个外显子，编码的蛋白分子结构域与经典的Ⅰ类分子α链相似，包括3个胞外结构域：α1、α2和α3，加上跨膜区和胞质区，不含β2m。MICA大量表达于上皮细胞和纤维母细胞的表面，在T、B细胞表面不表达，但在大多数上皮性肿瘤细胞表面都有表达。MICA分子与其配体NKG2D受体结合后可以激活NK细胞、Vδ1γδT细胞等，参与天然免疫应答。现已发现MICA与某些肿瘤和免疫相关性疾病（如白塞氏病、1型糖尿病）存在关联，并且在肿瘤和某些疾病的发展中起着重要作用。     

结肠癌组织中MICA和ADAM10的表达及其相关性

目的 研究MHC I类相关分子A(MHC class Ⅰ chain-related A,MICA)及ADAM10在结肠癌中的表达及其与临床病理学参数之间的关系,并探讨两者的相关性,为结肠癌细胞表面MICA蛋白脱落机制的研究提供组织学依据.方法 应用免疫组织化学方法,采用SP法检测有完整资料的90例结肠癌组织及30例癌旁组织中MICA和ADAM10的表达差异.结果 在癌组织和癌旁组织中,MICA蛋白表达阳性率分别为67.8%和7.1%,ADAM10蛋白表达阳性率分别为82.2%和20%,差异均具有显著性(P<0.01),并且与淋巴结转移有关(P<0.05),MICA与ADAM10表达呈负相关性(r=-0.258,P<0.05).结论 MICA的表达降低与ADAM10的表达升高,可能共同参与了肿瘤的免疫逃逸及肿瘤的转移;且ADAM10在膜型MICA的脱落机制中发挥重要作用.     

主要组织相容性复合体Ⅰ相关分子A(MICA)和MICB与终末期肾病相关性研究进展

终末期肾病(ESRD)是肾功能发生不可逆地衰退,病情进展至疾病的终末阶段。主要组织相容性复合体Ⅰ相关分子A(MICA)、 MICB是人组织相容性复合体Ⅰ类相关基因(MIC)家族的两个主要成员,有同样的跨膜蛋白结构,其基因均定位于6号染色体短臂的MHCⅠ类基因区,同源序列达90%以上。采用聚类分析法发现MICA、 MICB在ESRD患者体内肾小管上皮细胞中高表达,其诱导的微炎反应以肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、 IL-10升高为主要特征,高水平的MICA、 MICB脱落入血形成可溶性的MICA(sMICA)、 sMICB,与自然杀伤(NK)细胞表面的自然杀伤细胞家族2成员D(NKG2D)特异性结合,通过胞内内吞和降解抑制NK细胞活性,使微炎反应持续存在。采用高通量血液透析,避免透析通路隐匿性感染,可有效控制患者微炎反应。     

抗主要组织相容性相关蛋白MICA / B 的单克隆抗体制备及应用

目的:制备抗主要组织相容性相关蛋白A/ B(MICA/ B)的单克隆抗体并对其特异性进行验证。方法:以重组MICA*012 蛋白免疫小鼠后将其脾细胞与SP2/0 细胞进行融合和筛选得杂交瘤细胞株,并用ELISA 对其中9B10 细胞株产生的单克隆抗体进行效价检测以及通过Western blot、Luminex、免疫荧光对其特异性进行检测。结果:获得6 株杂交瘤细胞株,其中9B10 细胞株产生单克隆抗体(mAb)9B10 的最低反应浓度为0.02 ng/ μl,且mAb 9B10 可应用于Western blot、Luminex 和免疫组化荧光试验对MICA 和MICB 分子的检测。结论:成功获得可同时检测MICA 和MICB 表达的单克隆抗体9B10。     

Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步探讨

目的 探讨人B细胞淋巴瘤Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤的机制.方法 以K562细胞作为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时同种异体NK细胞杀伤Raji细胞的活性.并分别用PCR方法和流式细胞仪检测K562和Raji细胞MICA/B、ULBP1-3、HLA基因型和分子的表达情况.效靶比20∶1时用单抗分别阻断K562和Raji细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3和HLA-Ⅰ类分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化.结果 不同效靶比时NK细胞杀伤Raji细胞的活性明显低于杀伤K562细胞的活性,二者之间差异有统计学意义(P<0.05).K562细胞表达MICMB和ULBP1～3基因和分子,不表达HLA-Ⅰ类分子,Raji细胞表达ULBP1～3基因和HLA-Ⅰ类分子,不表达MICA/B和ULBP1～3分子.Raji细胞HLA基因型为A*3、3.B*71、71,Cw3、4.用单抗封闭MICMB和ULBP1～3分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,对Raji细胞的杀伤活性无明显改变.结论 Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制和Raji细胞高表达HLA-Ⅰ类分子,不表达NKG2D的配体MI-CA/B和ULBPI～3有关.     

SLE、RA患者血清sICAM-1和PTM水平的变化及其临床意义

系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)是多系统受累的自身免疫性疾病(aut oimmune diseases,AID),其免疫特征是,T细胞活化增加,B细胞多克隆活化并产生多种自身抗体,但其发病机制尚不清楚.可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular ad hesion molecules-1,sICAM-1),是表达于内皮细胞和其他抗原递呈细胞上的ICAM-1脱落于血液中的可溶性形式,属于免疫球蛋白超家族中的成员,为一种表面跨膜蛋白抗原.内皮细胞表面细胞黏附分子的异常表达是内皮细胞损伤的早期变化[1].