miRNA-223对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨microRNA-223（miR-223）在非小细胞肺癌（NSCLC）A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DDP耐药肺腺癌细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-223的水平,将A549／DDP细胞分为3组：对照组、空转染组（转染无关序列）和抑制组（转染miR-223 inhibitor）,于转染24、48、72及96 h后分别采用qRT-PCR和CCK-8法检测转染效果及细胞增殖情况,CCK-8法评价转染后A549/DDP细胞对DDP的药物敏感性变化,采用流式细胞术检测转染48 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,Western blotting检测转染48 h后耐药基因蛋白P 糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及肺耐药相关蛋白（LRP）的表达。结果 A549／DDP细胞中的miR-223水平较高,为A549细胞的（7.14±0.26）倍（P＜0.05）;抑制组转染后的miR-223水平降低,转染96 h后的miR-223水平分别降至对照组的（67.15±2.84）％和空转染组的（65.80±3.47）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期细胞比例均升高,而S和G2／M期细胞比例及3种耐药基因蛋白水平均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。DDP对抑制组细胞的半数抑制浓度（IC50）值为（15.67±1.30） μg／ml,低于对照组的（33.71±2.61） μg／ml（P＜0.05）。结论 miR-223可增加A549／DDP细胞对DDP的耐药性,可能与耐药基因蛋白表达上调有关;降低miR-223水平可抑制A549／DDP细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞,并下调耐药蛋白的表达,从而增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性。     

miRNA-451逆转非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制研究’

目的：探讨microRNA-451（miR-451）逆转非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂的耐药性及其可能的作用机制。方法：应用实时荧光定量PCR法（real～timefluorescentquantitativePCR,qRT—PCR）检测耐DDP细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-451的表达差异,同时检测A549／DDP细胞转染miR-451mimic后miR-451表达的变化;分别应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测转染后A549／DDP细胞对DDP药物敏感度,细胞增殖能力,联合DDP处理后细胞凋亡变化;Western印迹法检测转染后A549／DDP细胞Akt、P—Akt（Ser473）、bcl-2和bax的表达变化。结果：miR-451在耐DDP细胞株A549／DDP中的表达量显著低于敏感细胞株A549（P〈0．05）,A549／DDP细胞转染miR-451mimic24h后,细胞中miR-451的表达水平较对照组明显提高（P〈0．05）。在A549／DDP细胞中过表达miR-451可产生以下效应：相较于对照组,DDP对A549／DDP／miR-451细胞的半数抑制浓度（half inhibitioncon centration,IC50）减低（P〈0．05）,A549／DDP／miR-451细胞的增殖能力减弱,A549／DDP／miR-451经过DDP处理后细胞凋亡增多（P〈0．05）。Western印迹法结果显示,与对照组比较,转染miR-451mimic的A549／DDP细胞P—Akt（Ser473）、bcl-2表达水平降低;bax表达水平升高。结论：miR-451可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调bax蛋白及下调P—Akt（Ser473）、bcl-2蛋白表达而逆转A549／DDP细胞对DDP的耐药性。     

miRNA-451逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制研究

目的:探讨microRNA-451(miR-451)逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其可能的作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR法(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测耐DDP细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-451的表达差异,同时检测A549/DDP细胞转染miR-451 mimic后miR-451表达的变化;分别应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP药物敏感度,细胞增殖能力,联合DDP处理后细胞凋亡变化;Western印迹法检测转染后A549/DDP细胞Akt、p-Akt( Ser473)、bcl-2和bax的表达变化.结果:miR-451在耐DDP细胞株A549/DDP中的表达量显著低于敏感细胞株A549 (P ＜0.05),A549/DDP细胞转染miR-451 mimic24h后,细胞中miR-451的表达水平较对照组明显提高(P＜0.05).在A549/DDP细胞中过表达miR-451可产生以下效应:相较于对照组,DDP对A549/DDP/miR-451细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P＜0.05),A549/DDP/miR-451细胞的增殖能力减弱,A549/DDP/miR-451经过DDP处理后细胞凋亡增多(P＜0.05).Western印迹法结果显示,与对照组比较,转染miR-451 mimic的A549/DDP细胞p-Akt ( Ser473)、bcl-2表达水平降低;bax表达水平升高.结论:miR-451可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调bax蛋白及下调p-Akt( Ser473)、bcl-2蛋白表达而逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性.     

miR-1293促进非小细胞肺癌耐药分子机制探讨

目的microRNA与非小细胞肺癌耐药性密切相关,但miR-1293在非小细胞肺癌中的作用机制仍不清楚。本研究探讨miR-1293调控Akt信号通路促进非小细胞肺癌耐药的分子机制。方法培养人肺癌A549与耐药细胞株A549/DDP,RT-qPCR检测miR-1293和抑癌基因RUNX3 mRNA表达,蛋白质印迹检测RUNX3蛋白表达。采用脂质体法将miR-1293抑制物(miR-1293inhibitor)和阴性对照RNA(miR-NC)转染A549/DDP。MTT检测细胞IC50;流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白Bcl-2和RUNX3;荧光素酶报告基因检测miR-1293能否调控RUNX3;qPCR检测miR-1293和RUNX3的mRNA表达;蛋白质印迹检测MDR1/ABCB1、ABCC1、RUNX3、Akt和p-Akt蛋白表达。结果A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为7.23。miR-1293在耐药细胞株A549/DDP的表达(3.89±0.08,W=0.946,P=0.698)与A549组(1.01±0.05,W=0.938,P=0.622)相比升高,差异有统计学意义,t=74.78,P<0.001;而RUNX3 mRNA和RUNX3蛋白在耐药细胞株A549/DDP的表达与A549组相比降低,tmRNA=7.74,t蛋白=20.04,均P<0.001。与miR-NC比较,miR-1293 inhibitor组IC50降低,t=94.49,P<0.001。miR-1293 inhibitor组MDR1/ABCB1、ABCC1蛋白表达低于miR-NC,tMDR1/ABCB1=10.61,tABCC1=39.57,均P<0.001。与miR-NC比较,miR-1293 inhibitor组细胞凋亡增加,t=7.15,P<0.001。促凋亡蛋白RUNX3在miR-1293 inhibitor组表达更高,t=33.63,P<0.001;凋亡抑制蛋白Bcl-2表达更低,t=11.62,P<0.001。荧光素酶报告实验显示,在野生型RUNX33′UTR中,miR-1293 inhibitor的荧光素酶活性(6.24±0.04,W=0.911,P=0.399)高于miR-NC(3.21±0.07,W=0.879,P=0.221),t=92.06,P<0.001;提示RUNX3是miR-1293靶基因。miR-1293 inhibitor组RUNX3蛋白表达高于miR-NC,t=17.75,P<0.001;Akt1、p-Akt低于miR-NC组,tAkt1=67.55,tp-Akt=16.98,均P<0.001。结论在耐药细胞株A549/DDP中miR-1293高表达,抑制细胞凋亡,促进细胞耐药,其机制可能与靶向下调RUNX3,促进Akt信号通路激活有关。     

miR-155对乳腺癌细胞增殖、凋亡及耐药蛋白表达的调控作用研究

目的 探讨microRNA-155（miR-155）对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及乳腺癌耐药相关蛋白表达的调控作用。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测MCF-7细胞和人乳腺正常上皮细胞中miR-155的表达水平。将MCF-7细胞分为4组：对照组、空转染组、抑制（转染miR-155 inhibitor）组和过表达（转染miR-155 mimics）组,采用qRT-PCR检测转染24、48、72及96 h后各组的转染效果,噻唑蓝（MTT）法检测各组转染24、48、72及96 h的增殖能力,采用流式细胞仪PI／Annexin V双染色法检测各组转染24、48 h后的凋亡率,Western blotting法检测各组转染48 h后乳腺癌耐药蛋白（BCRP）、P-糖蛋白（P-gp）及多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达水平。结果 乳腺癌MCF-7细胞中的miR 155水平高于人乳腺正常上皮细胞（P＜0.05）,且转染miR-155 inhibitor或mimics可呈时间依赖的方式降低或升高MCF-7细胞的miR-155水平（P＜0.05）。与对照组相比,抑制组转染后的细胞增殖率及BCRP、P-gp和MRP1的表达水平均降低,凋亡率升高（P＜0.05）;而过表达组的细胞增殖率及BCRP、P gp和MRP1的表达水平均升高,凋亡率降低（P＜0.05）。结论 MCF-7细胞中miR-155呈高表达,下调miR-155表达可抑制其增殖及耐药相关蛋白的表达,同时诱导凋亡。     

miRNA-139-5p通过靶向调控CXCR4/CXCL12信号通路逆转非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药

目的:探讨miRNA-139-5p对非小细胞肺癌A549细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药的影响,及其可能的分子机制。方法:采用DDP浓度递增法诱导A549细胞建立DDP耐药细胞株A549/DDP,将miR-139-5p mimics、无义序列（mimics-NC）、CXCR4过表达质粒（pcDNA3.1-CXCR4）、pcDNA3.1空载质粒（Vector）转染至A549/DDP细胞中,将细胞分为mimics-NC组（转染无义序列）、mimics组（转染miR-139-5p mimics）、mimics+Vector组（共转染miR-139-5p mimics和空载质粒）和mimics+CXCR4组（共转染miR-139-5p mimics和CXCR4过表达质粒）,另设置空白对照组（blank）。不同浓度DDP处理,MTT法检测细胞增殖活性,并计算IC50值和耐药指数（resistance index,RI）;qRT-PCR法检测细胞中miR-139-5p和CXCR4 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及CXCR4/CXCL12信号通路相关蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p与CXCR4的靶向关系。结果:不同浓度DDP处理24 h后,耐药株A549/DDP及其亲本A549细胞IC50值分别为（208.87±27.89）μmol/L和（31.66±6.30）μmol/L,RI=6.59。与亲本A549细胞比较,耐药株A549/DDP中miR-139-5p的表达水平明显降低（P＜0.05）,而CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与mimics-NC组比较,mimics组A549/DDP细胞增殖活性明显降低（P＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,细胞中CXCR4 mRNA和蛋白以及P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT/AKT等蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与mimics+Vector组比较,mimics+CXCR4组A549/DDP细胞增殖活性显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,而细胞中CXCR4、P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT等蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-139-5p靶向负调控CXCR4表达。结论:miRNA-139-5p通过靶向下调CXCR4表达,提高非小细胞肺癌DDP耐药细胞株A549/DDP对DDP的药物敏感性。     

siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

培美曲塞对不同miR-21表达水平人肺癌细胞凋亡影响的实验研究

目的 检测不同miR-21表达水平的人肺癌细胞对培美曲塞的药物敏感性,并探讨可能作用机制。方法 采用Annexin V-EGFP荧光染色法定性检测及流式细胞术定量检测培美曲塞对不同miR-21表达水平的A549人肺癌细胞凋亡诱导作用,级联酶底物显色法检测caspase-3的活化状态,蛋白免疫杂交法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、 Bax的表达水平变化。结果 20μmol／L培美曲塞作用24h可以诱导高表达miR-21的A549人肺癌细胞（A549-21H0）和低表达miR-21的A549细胞（A549-21L0）的凋亡,且A549-21L0处于细胞凋亡晚期,而A549-21H0处于细胞凋亡早期。5μmol／L培美曲塞作用24h可以诱导65.3％的A549-21L0 细胞早期凋亡,仅诱导2.8％的A549-21H0细胞早期凋亡。5μmol／L培美曲塞作用6h即可引起A549-21L0细胞中caspase-3活化,与作用前相比活化效应超过2倍（P＜0.01）;在9h时活化效应最强,活化效应超过7倍（P＜0.01）;18h后活化效应超过6倍（P＜0.01）;至24h时活化效应仍在5倍以上（P＜0.01）。同样条件下,5μmol／L培美曲塞作用18h才引起A549-21H0细胞中caspase-3活化,与作用前相比活化效应接近3倍（P＜0.01）,至24h活化效应在4倍以上（P＜0.01）。5μmol／L培美曲塞作用于A549-21L0细胞9h即可引起Bax表达水平显著性升高和Bcl-2表达水平明显下降。结论 A549-21L0人肺癌细胞对培美曲塞诱导的细胞凋亡具有更高的敏感性。培美曲塞可引起A549-21L0细胞中caspase-3活化,并可通过调控Bax和Bcl-2表达水平诱导凋亡,这种效应具有一定的时间-效应关系。     

miR-134靶向EGFR对非小细胞肺癌增殖的影响

目的 探讨微小RNA-134（miR-134）对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测miR 134在NSCLC细胞株（A549、H252）和正常胚肺细胞株WI38中的表达情况;将A549和H252细胞分为3组,分别为空白对照组（不转染）、miR-NC组（转染不相关siRNA）和miR-134组（转染miR-134 mimics）。分别于转染后24、48、72、96h收集细胞,采用MTS法检测细胞的增殖情况;转染后96h用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验检测miR-134与表皮生长因子受体（EGFR）3’UTR的结合情况,QPCR检测过表达miR-134的A549和H252细胞中EGFR的表达情况。结果 与WI38 细胞相比,miR-134在A549细胞中的表达下调85.91％,在H252细胞中下调78.13％（P＜0.05）。MTS检测显示,miR-134能显著降低A549和H252细胞的增殖能力,并呈时间依赖性。流式细胞仪检测显示,与空白对照组比较,miR-134组A549细胞的凋亡比例提高226.31％,H252细胞提高47.85％（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示miR 134能与EGFR3’UTR结合,显著降低荧光值（P＜0.05）。QPCR检测显示,与空白对照组比较,转染miR-134 mimics 后,EGFR在A549细胞中的相对表达量下调57.0％,在H252中下调35.0％,差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 miR-134在NSCLC中低表达,能通过靶向EGFR抑制NSCLC细胞增殖,并诱导凋亡。     

miRNA-200c对非小细胞肺癌A549细胞甲氨蝶呤耐药性的影响

目的 探讨miRNA-200c（miR-200c）在非小细胞肺癌A549细胞耐甲氨蝶呤（MTX）（A549/MTX）中的影响及可能的作用机制。方法 通过实时荧光定量（qRT-PCR）法检测人肺癌亲本细胞株A549细胞、转染miR-200c模拟物（mimic）的A549/MTX细胞（A549/MTX-M）及转染miR- 阴性对照（NC）A549/MTX细胞（A549/MTX-N）中miR-200c的表达水平。分别采用MTT法、锥虫兰染色及流式细胞术检测三组细胞对MTX的药物敏感度、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,并采用qRT-PCR检测其P53和P21基因表达的变化。结果 miR-200c在A549细胞中的表达水平显著高于A549/MTX-N细胞;A549/MTX-M细胞miR-200c水平高于A549/MTX-N细胞;用不同浓度MTX刺激细胞,与A549/MTX-N细胞比较,A549/MTX-M细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多,并呈剂量依赖性,差异均有统计学意义。转染miR-200c mimic后,P53和P21基因表达水平上升,与转染miR-NC细胞比较,差异有统计学意义。结论 miR-200c能够逆转A549/MTX细胞对MTX的耐药性,其作用机制可能是通过P53/P21信号转导通路诱导细胞凋亡来实现的。     

上调miR-125a对肺癌A549细胞凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨上调microRNA-125a（miR-125a）对肺癌A549细胞凋亡的影响及可能机制。方法 人工合成miR-125a基因序列,将miR-125a基因克隆至真核表达载体pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-miR-125a,同时设计并构建阴性对照质粒pGenesil-control。将以上载体经脂质体介导转染肺癌A549细胞并分为3组：成功转染pGenesil miR-125a的A549细胞（A549-miR-125a组）,成功转染pGenesil-control的A549细胞（A549-control组）,以及未进行转染的A549细胞（A549组）。采用实时定量PCR技术（QPCR）检测各组细胞的miR-125a表达水平,Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫印迹法检测p53基因的蛋白水平。结果 经酶切和测序鉴定证明pGenesil-miR-125a重组质粒构建成功。A549-miR-125a组的miR-125a水平为2.72±0.41,高于A549-control组的0.97±0.16和A549组的0.96±0.11（P＜0.01）;A549-miR-125a组的细胞凋亡率为（31.04±2.48）％,高于A549-control组的（6.91±0.72）％和A549组的（6.73±0.56）％（P＜0.05）;A549-miR-125a组的p53蛋白水平为3.91±0.46,高于A549-control组的1.01±0.06和A549组的0.99±0.04（P＜0.01）。结论 上调miR-125a可促进肺癌细胞的凋亡,提示其在肺癌的发生、发展中有重要作用,可能的机制是上调p53的蛋白表达。     

miR-126对细胞周期的调控及其与肺癌患者预后的关系

目的研究miR-126在肺癌中的表达变化及其与癌细胞周期调控的关系,并分析miR-126表达对肺癌患者术后生存期的影响。方法对肺癌细胞株A549和49例临床肺癌手术标本进行实时定量RT-PCR检测miR-126的表达;A549细胞转染miR-126表达载体,MTT和流式细胞术检测miR-126表达对癌细胞增殖和细胞周期的影响;Kaplan-Meier曲线和log-rank分析方法比较miR-126高、低表达组之间无瘤生存期和总生存期的差别。结果A549肺癌细胞miR-126低表达（2.10±0.67）,转染miR-126表达载体后,miR-126表达升高（12.33±1.67）;转染miR-126后96小时,A549细胞存活率为（68.33±6.67）%,明显低于亲本A549细胞（105.33±8.58）%,差异有统计学意义（P〈0.001）;与亲本A549细胞比较（G0/G1期：37.48±3.28;S期：62.03±5.23）,转染miR-126的A549细胞G0/G1期细胞比例上升（53.67±6.06）,S期下降（43.21±3.75）,差异有统计学意义（P〈0.001）;肺癌组织miR-126表达水平（12.41±4.34）明显低于癌旁肺组织（23.29±6.28）,差异有统计学意义（P〈0.001）;miR-126高表达组无瘤生存期和总生存期均明显高于低表达组（P〈0.01,P〈0.001）。结论 miR-126在肺癌的发生、发展中有重要作用,可能成为肺癌治疗的可选靶点之一。     

Wnt／β-catenin信号转导通路与肺腺癌顺铂耐药作用机制研究

目的：探讨Wnt／β-catenin信号转导通路在肺腺癌顺铂耐药中的分子作用机制。方法：体外常规培养人肺腺癌A549细胞和其顺铂耐药A549／DDP细胞,取对数生长期的细胞用于实验。采用MTT法检测A549和A549／DDP细胞对顺铂的IC50;采用AnnexinV／PI法和Hoechst33342染色法检测顺铂处理后2种细胞的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测2种细胞中β-catenin和Survivin的表达;采用siRNA干扰沉默pcatenin的表达,检测A549／DDP细胞的Ic5。值、细胞凋亡率及β-catenin和Survivin的表达。结果：顺铂对A549／DDP细胞的IC50值为（28．984±1．404）μmol／L高于A549细胞的（5．888±0．338）umol／L,t=27．696,P〈0．001;20umol／L顺铂诱导A549／DDP细胞凋亡率为（21．75±0．96）％,显著低于A549细胞的（39．38±0．88）％,t=23．474,P〈0．001。A549／DDP细胞中β-catenin蛋白的表达为1．890±0．060,显著高于A549细胞的1．063±0．035,t=20．595,P〈0．001;在A549／DDP细胞中Survivin蛋白表达量为1．107士0．061,明显高于A549细胞的0．503±0．025,t=15．814,P〈0．001。RNAi技术沉默β-catenin蛋白耐药性（14．615±0．939）gmol／L,显著低于未沉默β-cateninA549／DDP细胞的（28．984±1．404）μmol／L,t=14．732,P〈0．001;RNAi技术沉默pcatenin蛋白细胞凋亡率为（37．57±0．64）％,显著高于未沉默β-cateninA549／DDP细胞的（21．75±0．96）％,t=23．699,P〈0．001;RNAi技术沉默伊catenin蛋白下游靶基因Survivin蛋白的表达为0．527±0．065,显著低于A549／DDP组的1．027±0．025和瞬时转染阴性对照siRNA组的1．033±0．040,F=116．944,P〈0．001。结论：抑制Wnt／β-catenin信号转导通路的活性可以降低A549／DDP细胞对顺铂的耐药性。     

醉茄素A对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡及PI3K／Akt信号通路的影响

目的 探讨醉茄素A（WFA） 对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞增殖、凋亡及PI3K／Akt信号通路的影响。方法 采用0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol／L WFA 处理A549细胞,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测上述浓度处理24、48、72和96h的细胞增殖抑制率,Hoechst染色和磷酯酰丝氨酸结合蛋白 异硫氢酸荧光素／碘化丙啶双染法（Annexin V-FITC／PI）检测各浓度组48h的细胞凋亡情况,流式细胞仪检测各浓度组48h的细胞周期分布情况,免疫印迹检测各浓度组48h凋亡相关基因（Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3）和PI3K／Akt信号通路重要蛋白Akt及其磷酸化形式p-Akt的蛋白水平。结果 WFA 可抑制细胞增殖,并呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）;0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol／L WFA作用48h后A549细胞的凋亡指数分别为2.75±0.64、4.61±1.36、9.75±2.78、12.92±3.42和18.68±4.31,组间差异有统计学意义（P＜0.05）。除2.5μmol／L外,其余浓度组的早、晚期凋亡率、凋亡促进基因（Bax和Cleaved caspase-3）水平及G0／G1期细胞比例均高于0μmol／L,凋亡抑制基因Bcl-2水平及S期和G2／M期细胞比例均低于0μmol／L（P＜0.05）; 2.5、5.0、10.0、20.0μmol／L的组间差异有统计学意义（P＜0.05）。随着浓度升高,p-Akt／Akt值呈降低趋势,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 WFA能够抑制A549细胞的增殖及凋亡,可能通过抑制PI3K／Akt通路激活实现。     

miR-125a表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响分析

目的 探讨microRNA-125a（miR-125a）对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测人肝癌HepG2细胞及人正常肝细胞7702中的miR-125a水平,同时采用真核表达载体pGenesil-1质粒制备过表达miR-125a的重组质粒pGenesil-miR-125a及表达随机序列的阴性对照pGenesil-NC,根据实验设计将HepG2细胞分为3组：空白对照组、阴性对照组和过表达组,其中空白对照组未进行转染,阴性对照组和过表达组分别成功转染pGenesil-NC和pGenesil-miR-125a,待3组转染24、48、72及96 h后采用qPCR法检测各组的miR-125a水平,噻唑盐比色法检测各组转染24、48、72及96 h的细胞增殖率,分别采用Hoechst染色和流式细胞术检测转染24、48 h后的凋亡指数和caspase-3活化率来评价凋亡情况,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组转染48 h后的细胞周期,同时采用免疫印迹法检测转染48 h后对凋亡相关基因（Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3）表达的影响。结果 HepG2细胞中miR-125a水平为（0.24±0.06）,低于正常肝细胞7702细胞（P<0.05）;与阴性表达组相比,过表达组转染24、48、72及96 h的miR-125a水平升高,增殖率降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与其余两组相比,过表达组转染后的凋亡指数、caspase-3活化率、G0/G1期细胞比例及Bax和Cleaved caspase-3水平均升高,S和G2/M期细胞比例及Bcl-2水平均降低,以上差异有统计学意义（P<0.05）。