Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞

目的:探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)直接重编程为神经干细胞的方法,为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)作为种子细胞治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。方法:逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后,悬浮、贴壁反复循环培养3次。Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。i NSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将i NSCs显微注射至小鼠大脑皮质,7~14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果:Real-time PCR显示i NSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高(P0.05),且i NSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示i NSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明i NSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。i NSCs具有自我更新的能力,且在体内外都具有三向分化潜能,可作为修复SCI合适的种子细胞。     

颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定

目的:研究颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定,为立体定向自体神经干细胞移植治疗脑出血、脑梗塞及颅脑损伤后遗症提供临床前基础。方法:通过改进原代培养方法,从颅脑手术患者废弃脑组织中培养和鉴定神经干细胞(NSCs)。收集颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织各约500 mg以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过免疫荧光检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达,传代培养5代时开始进行诱导分化。结果:培养约3～10 d后,多数患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,经Nestin免疫荧光检测均呈阳性表达。选取第6代诱导分化后的贴壁细胞分别经β-Tubulin(神经元标志物)、Sox10(少突胶质细胞标志物)与GFAP(星形胶质细胞标志物)免疫荧光检测,可见少量神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞阳性表达。取第3代与第6代细胞行免疫印迹鉴定,第3代细胞仅见Nestin与少量β-Tubulin表达,第6代细胞可见不同程度的Nestin、β-Tubulin、Sox10及GFAP等表达。结论:本研究成功从颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织中分离培养获得成人NSCs,并可向神经元及神经胶质细胞分化,使立体定向自体神经干细胞移植促进神经功能修复从实验室到临床应用成为可能。     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

小鼠海马神经元细胞系HT22微环境诱导BMSCs神经分化

目的探讨小鼠海马神经元细胞系HT22的微环境对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的定向诱导作用。方法分别培养HT22细胞和GFP转基因荧光小鼠的BMSCs;直接接触法和间接接触法共培养,荧光显微比较GFP标记的干细胞形态变化;收集间接接触共培养的BMSCs行Western blot检测神经相关的蛋白(GFAP,NSE)的表达和变化;利用免疫荧光法检查GFAP和NSE抗原在细胞内的表达。结果培养的骨髓贴壁细胞为CD11b、CD45阴性,CD90阳性。与HT22细胞直接接触共培养及间接接触共培养的BMSCs细胞长轴增长,轴突样突起明显;经HT22细胞培养液诱导的BMSCs内GFAP、NSE表达水平随时间增加而增强;与HT22细胞直接接触共培养诱导的BMSCs表达GFAP和NSE。结论小鼠海马神经元细胞系HT22的微环境可诱导BMSCs向神经元样细胞分化。     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

bFGF和EGF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经样细胞

 目的 探讨bFGF和EGF诱导大鼠BMSCs成神经分化潜能及其表型变化。方法 全骨髓贴壁法分离培养BMSCs,流式细胞仪检测P3代细胞表面标志物CD90、CD45。P3代细胞分为1）对照组（1%胎牛血清+DMEM/F-12）,2）EGF组(20ng/mLEGF）,3）bFGF组(20ng/mLbFGF),4）EGF+bFGF组(20ng/mLEGF+20ng/mLbFGF)行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态,Western blot检测细胞内NSE及GFAP蛋白的表达,RT-PCR检测其mRNA。结果 BMSCs呈长梭形或扁平形,漩涡样排列,CD90表达高达98.72%,而CD45仅1.05%;诱导后胞体收缩,折光性增强,呈双极甚至复杂的多极,向周围伸出明显突起,呈典型的神经样细胞;NSE、GFAP蛋白EGF组、bFGF组、EGF+bFGF组表达均高于对照组,bFGF组、EGF+bFGF组高于EGF组,且EGF+bFGF组高于bFGF组,EGF组高于对照组（p<0.05）;mRNA变化与上述结果类似。结论 bFGF和EGF可促进大鼠BMSCs向神经分化,二者合用时效果最显著,且bFGF促BMSCs向神经分化的能力强于EGF。为BMSCs移植治疗周围神经疾患提供了理论基础。     

灯盏花素注射液对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探索灯盏花素注射液体外诱导大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)分化为神经元和胶质细胞的可行性。方法贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质细胞。第4代细胞行表型鉴定后,用灯盏花素注射液诱导,每6h倒置相差显微镜观察形态变化,免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞的神经元特异性稀醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测不同浓度灯盏花素注射液诱导后细胞的活力,流式细胞术及RT-PCR检测诱导前后细胞中NSE、GFAP mRNA的表达变化。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,诱导18h后BMSCs胞体开始收缩,有突起伸出,24h后突起增多形成网络结构。免疫细胞化学染色,NSE阳性表达率为(48.7±3.4)%,GFAP阳性表达为(56.8±4.2)%,流式细胞仪检测诱导24h后的细胞NSE及GFAP蛋白表达量均较未诱导组升高,RT-PCR检测诱导后细胞表达NSE、GFAP mRNA,未诱导的细胞则不表达。结论灯盏花素注射液可诱导大鼠骨髓间充质细胞在体外分化为神经元和神经胶质细胞。     

鼠巨细胞病毒影响神经干细胞分化及分化基因的表达

目的： 研究鼠巨细胞病毒（MCMV）感染对体外培养神经干细胞（NSCs）分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致脑发育异常的机制。方法: 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs,检测细胞分化潜能,用感染复数（MOI）为5、1和0.1 MCMV smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物nestin、GFAP和NSE表达的变化,采用MCMV 早期抗原（EA）示踪感染过程（MOI=1）,实时定量RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Neurog2、Myc及Ccnd1 mRNA水平的动态变化。结果: 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记nestin表达阳性,并可进一步分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,GFAP和NSE表达显著低于正常对照组（P<0.05）,可检测到MCMV EA（早期抗原）的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组（P<0.05）;感染组Neurog2 mRNA水平在分化培养后第1 d明显低于正常对照组（P<0.05),感染组Myc mRNA表达水平在第1-4 d显著低于正常组（P<0.05),感染组Ccnd1 mRNA水平在第0.5-1 d明显低于正常组;感染组和正常组的差异随病毒MOI的增加而更明显。结论: (1)MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;(2)MCMV可下调或干扰NSCs Wnt信号途径分化基因Neurog2、Myc和Ccnd1的表达;(3)MCMV抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;(4)MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV感染致脑发育异常的重要机制之一。     

bFGF通过上调ERK表达诱导BMSCs向神经胶质样细胞分化

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞增殖与分化的作用及其可能机制。方法从SD大鼠骨髓中获得BMSCs,纯化培养传代后用不同浓度的bFGF诱导,经MTT法检测bFGF对BMSCs生长的影响,应用透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化,免疫细胞化学染色显示GFAP表达,Western blot方法分析p-ERK蛋白表达。结果 bFGF对BMSCs具有促增殖作用,在倒置光显微镜和透射电镜下可见到有神经胶质样细胞形成,免疫细胞化学证明GFAP的表达较对照组显著增高(P<0.01),Western blot证明bFGF上调ERK蛋白表达(P<0.05)。结论 bFGF可活化Ras/ERK信号转导通路,促进BMSCs细胞增殖分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞。     

不同血清浓度对bFGF联合EGF诱导BMSCs向神经细胞分化的影响

目的:探讨不同血清浓度条件下碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)联合表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经细胞分化方向的影响。方法:全骨髓贴壁法体外分离培养BMSCs,流式细胞法检测BMSCs表面骨髓基质标志CD90和造血细胞标志CD45,MTT法绘制第3(P3)代BMSCs生长曲线。取P4代细胞分为3组给予不同诱导条件,分别给予含20 ng/ml的bFGF和20 ng/ml EGF的无胎牛血清(A组)、10 ml/L胎牛血清(B组)及100 ml/L胎牛血清(C组)的DMEM/F-12培养液进行诱导,倒置显微镜观察细胞的形态变化,诱导6 d时免疫组织化学法检测细胞内神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,台盼蓝染色检测各组细胞的活力。结果:BM-SCs经3-4次传代培养后形态大致呈单一的长梭形或扁平形,流式细胞鉴定显示CD90阳性,CD45阴性;细胞生长曲线近似呈"S"形;诱导后可见细胞胞体收缩,呈双极、多极并伸出突起;诱导6 d时3组活细胞率分别为:86.57%、95.29%、97.32%;免疫组化各组均见NSE、GFAP表达,3组NSE阳性率高于GFAP,A组NSE阳性率高于B、C组,差异具有统计学意义(P<0.01),C组NSE阳性率高于B组,差异具有统计学意义(P<0.01),A组GFAP阳性率低于B、C组,差异具有统计学意义(P<0.01),C组GFAP阳性率高于B组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:bFGF联合EGF可诱导BMSCs向神经细胞分化,在无血清条件下趋向于向神经元分化,在高浓度血清条件下趋向胶质细胞分化。     

不同浓度的银杏内酯B 对培养的神经干细胞分化的影响

目的探讨不同浓度的银杏内酯B对神经干细胞分化的影响。方法从新生大鼠海马中分离和培养神经干细胞。将其接种在24孔培养板中，并分成4组：20mg／L内酯B组、40mg／L内酯B组、60mg／L内酯B组和对照组。4组神经干细胞被分别加入含不同浓度银杏内酯B的DMEM／F12培养液，在培养7d和14d后，用免疫细胞化学染色方法检测其神经丝蛋白(NF)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及少突胶质细胞特异性蛋白(Oligo)的表达，并计算阳性染色细胞的百分率。结果在同一时间内不同浓度银杏内酯B组分化为NF阳性神经元样细胞的百分率都比对照组高，但不同浓度之间没有显著差异。在同一时间内不同浓度银杏内酯B对少突胶质样细胞的百分率影响不大。而不同浓度银杏内酯B组分化为GFAP阳性星形胶质样细胞的百分率都比对照组高，并随其浓度的增加而百分率增高。结论不同浓度的银杏内酯B可促进神经干细胞向神经元样细胞分化，似与其浓度关系不大；对少突胶质样细胞的百分率影响不大；对星形胶质样细胞的百分率有促进作用，并随浓度的增加而增高。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.