TH基因修饰的中脑星形胶质细胞的建立

目的 体外构建酪氨酸羟化酶(TH)基因修饰的中脑星形胶质细胞,为进行帕金森病(PD)的转基因细胞治疗奠定基础。方法 应用逆转录病毒表达载体将鼠TH基因转入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G418抗性筛选,获取高滴度产毒PA317／pN2ATH细胞株,以其产生的病毒上清感染鼠中脑星形胶质细胞,继续培养7～9d后,免疫组化检测细胞TH表达。结果获得了高滴度产毒PA317／pN2ATH细胞,并且转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞成功表达TH。结论转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞可以有效表达TH,为将其应用于PD基因治疗实验研究提供了基础。     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

葡萄糖转运蛋白-2逆转录病毒表达载体构建/包装及其鉴定

目的 构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础.方法 质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;转pL-GLUT2-SN至包装细胞系PA317,G418抗性筛选,检测上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆行PCR及RT-PCR鉴定.结果 建立GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;所建稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT2,其最高病毒滴度达7.1×105 CFU/ml,PCR及RT-PCR证实GLUT-2基因整合入其中并稳定表达.结论 成功构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为"人工胰岛β细胞"的构建奠定了基础.     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

病毒包装细胞PA317/HGSTπ的建立

目的建立产逆转录病毒的PA317/HGSTπ细胞株,为进一步把耐药基因GSTπ导入造血干细胞以逆转卵巢癌化疗药物对骨髓的毒副作用的研究奠定基础.方法用限制性内切酶HpaⅠ、BamhⅠ分别双酶切质粒pLXSH-GSTπ和pLXSN,回收GSTπ小片段和pLXSN大片段,在T4连接酶的作用下,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-GSTπ;酶切鉴定后用脂质体转染PA317包装细胞,G418筛选获得抗性克隆,用Hela细胞测定病毒滴度.结果 (1)酶切证实pLXSN-GSTπ和pLXSH-GSTπ的目的片段完全一致,表明重组质粒构建成功;(2)G418筛选获得多个抗性克隆,Hela测定病毒滴度最高为2.2×103CFU/ml.结论本研究成功建立了产病毒包装细胞株PA317/HGSTπ,该细胞株能产生含有耐药基因GSTπ的逆转录病毒,为进一步将HGSTπ应用于卵巢癌的大剂量化疗中奠定了良好的基础.     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-2A,脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建

目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA 317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

人NF-κB亚基p65、p5 0基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定

目的 构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、pS0基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株.方法 以ReCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定.将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株.收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72 h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达.结果 重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确.将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6 × 105、2×105及1 × 105efu/ml.pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72 h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72 h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色.结论 成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株.为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础.     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

iNOS转基因在血管平滑肌细胞的表达

目的 研究逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）中的表达。方法 通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSNiNOS导入PA317细胞中；经G418筛选获得抗性克隆；用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度；将病毒上清转染体外培养的VSMC；采用RT-PCR、Western blot检测VSMC内iNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PLXSNiNOS转染体外培养的VSMC48h后，在VSMC内可检测到外源性iNOS mRNA和蛋白；而用PLXSN转染体外培养的VSMC48h后未能检测到外源性iNOS mRNA和蛋白表达。结论 逆转录病毒介导iN0s基因可高效转染体外培养的VSMC，并在细胞内表达iNOS蛋白。     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

Construction of Retroviral Vectors Containing Rat Fas Ligand Gene and FasL Expression Mediated by the Vectors in Hepatocellular Carcinoma Cells

Apoptosis is a form of cell death differentfrom necrosis.It is believed to be the essentialphysiologic process underlying controlled or pro-grammed celldeletion during phenomena such asembryonic development,cell differentiation,ortissue turnover[1] .Fas antigen or Apo- 1 ( recent-ly designated as CD95 ) is now known to belongto the TNF/ nerve growth factor receptor fami-ly.Itis a48- ku type transmembrane glycopro-tein.Fasreceptormakesan importantcontribu-tion to determining the lymphocyte l…