血管内皮生长因子在新生鼠胫骨生长板软骨细胞中的表达

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）在鼠生长板软骨细胞增殖、分化和矿化过程中的自分泌作用。方法：新生鼠（1～2d）10只．切取干骺部软骨组织，采用免疫组织化学方法（5只）和RT—PCR方法（5只），检测VEGF及其受体Flt-1和KDR/Flk-1在胫骨生长板中的表达。结果：免疫组织化学染色VEGF、Fit-1和KDR／Flk-1在生长板的上肥大区、下肥大区和矿化区中的软骨细胞表达强阳性，在增殖区少数软骨细胞中呈阳性表达，在静止区软骨细胞中表达阴性。RT—PCR检测的5只鼠中除1只不表达Flt-1外，VEGF（251bp）、Flt-1（272bp）和KDR/Flk-1（252bp）在软骨组织中均清晰表达。结论：VEGF及受体Flt-1和KDR／Flk-1在生长板软骨中的表达具有高度一致性，并且随着软骨细胞的分化成熟表达逐渐增强。提示VEGF在生长板软骨细胞的增殖、分化和矿化过程中，可以自分泌作用方式起重要调节作用。     

体外家兔骺板软骨细胞和复合支架材料构建人工骺板软骨

目的：探讨采用复合支架材料构建人工骺板软骨的可行性。方法:分离获得骺板软骨细胞,加入0.3% Ⅰ型胶原酸性溶液、1 000 U·mL^-1凝血酶溶液及20 g·L^-1人血冻干纤维蛋白原混匀,成为胶冻样软骨组织培养物。定期取培养块固定,常规石蜡切片,行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化检查。结果：新制成的以胶原-纤维蛋白混合凝胶为支架材料的软骨细胞培养物呈浅粉红色胶冻样 ,细胞均匀分布于其中。培养3 d后悬浮物呈乳白色,透光度降低。逐渐缩小至直径约7 mm大小,硬度逐渐增加。HE染色见软骨细胞位于软骨陷窝内,软骨细胞培养物有一定层次感,但没有象骺板样排列成柱状。甲苯胺蓝染色显示胞体周围有丰富的软骨基质。免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原阳性细胞。结论：利用混合支架构建的人工骺板软骨在大小及可塑性等方面结果较满意。     

人工骺板软骨对家兔骺板损伤的修复作用

目的：探讨人工骺板软骨移植修复骺板损伤。 方法：切除家兔左侧胫骨上端骺板软骨约1/3～1/2,制备人工骺板软骨构件移植入该骺板损伤处;右侧胫骨近端骺板损伤后不进行移植作为对照。连续观察家兔双下肢外观及运动状态,摄双侧下肢X线片,测量胫骨角进行比较。行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化进行组织形态学观察。结果：移植8周时双下肢胫骨角,对照组为(38.80±13.50)°,人工骺板软骨移植组为(9.01±4.2)°;移植24周时对照组为(54.25±18.33)°,人工骺板软骨移植组为 (11.27±5.1)°,对照组与人工骺板软骨移植组相比差异均有显著性（P<0.01）。术后2周,对照组胫骨近端骺板内侧缺损处有骨桥形成,无软骨修复组织;而实验组移植后2周时,骺板缺损区已由软骨修复充填,移植的骺板软骨细胞排列未见层次及柱状排列状态,与正常骺板软骨相邻处分界明显;移植4周以后的骺板软骨细胞开始出现柱状排列状态,层次较明显。移植的骺板软骨Ⅱ型胶原染色阳性。结论：人工骺板软骨应能够修复骺板软骨损伤,效果满意。     

转化生长因子—β对骺软骨细胞增殖和PCNA表达的影响

采用１４天鸡胚股骨无血清培养、５－溴尿嘧啶核苷（ＢｒｄＵ）掺入标记和细胞核增殖抗原（ＰＣＮＡ）免疫染色方法，研究转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）对骺软骨细胞增殖的作用。结果显示：ＢｒｄＵ阳性软骨细胞数目与分布都位于ＴＧＦ－β作用剂量和时间密切相关，ＴＧＦ－β可以促进骺板成熟区和肥大区软骨细胞增殖，与ＢｒｄＵ标记相比，ＰＣＮＡ阳性细胞分布区域和数目远多于前者，根据染色情况可以将ＰＣＮＡ阳性细胞分为Ｓ期和Ｓ期细胞两种。结论：ＴＧＦ－β参与和调节骺软骨各部位软骨细胞增殖活动，并能诱导非增殖软骨细胞表达ＰＣＮＡ，用ＰＣＮＡ作为细胞增殖的指标是不适宜的。     

大骨节病与骨关节病患者软骨细胞凋亡及其机制的比较研究

目的比较分析大骨节病与骨关节病关节软骨中细胞凋亡及相关调控因子Bcl-2、Bax、Fas及iNos的表达分布特点，探讨两病发病机制的异同。方法收集大骨节病和骨关节病的关节软骨各15例．并以15例正常人作对照。采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记（TUNEL）技术和免疫组化抗生物素蛋白-生物素-碱性磷酸酶（B-SA）法染色，观察大骨节病、骨关节病和正常对照关节软骨的凋亡细胞和Bcl-2、Bax、Fas及iNOS蛋白阳性表达率及其分布特点。结果（1）大骨节病及骨关节病关节软骨凋亡阳性细胞数较正常关节软骨增多（F=20．90～53．16，df=42，P〈0．01），且关节软骨剥蚀区的凋亡阳性细胞数较未剥蚀关节软骨区增多（t=4，154-6.004，df=28，P〈0.01），但大骨节病与骨关节病之间软骨细胞凋亡阳性数无显著性差异（t=1.329～1.362，df=28，P〉0.05）。（2）大骨节病与骨关节病关节软骨Bcl-2、Bax、Fas及iNos表达阳性细胞数较正常关节软骨增多（F=25.46-215.31，df=42，P〈0．01），且关节软骨剥蚀区Bcl-2、Bax、Fas及iNos表达阳性细胞数较未剥蚀区增多忙2．278～7.77，df=28，P〈0．05），但大骨节病患者与骨关节病Bcl-2、Bax、Fas及iNos的表达阳性细胞数无显著性差异（t=0.284-1．590，df=28，P〉0．05）。结论大骨节病与骨关节病均有相似的细胞凋亡，而且凋亡机制相同，即Bcl-2、Bax、Fas及iNos途径。     

凋亡在软骨细胞分化中的作用

目的：探讨凋亡在软骨细胞分化中的作用。方法：采用透视电镜和TUNEL方法,检测5和12周龄的正常家兔肋软骨细胞的凋亡变化。结果：软骨细胞的增殖和分化是渐进过程,透视电镜结果表明软骨细胞的凋亡从增殖带和肥大带交接处开始出现;TUNEL结果表明凋亡存在整个软骨组织区,但以肥大带凋亡率高,且 此凋亡率随年龄增加而增高。结论：家兔肋软骨生长板软骨细胞从静止区到骨化区细胞的增殖和分化是一个渐进过程,在此过程中凋亡可能起着重要的调节作用。     

胎儿股骨骺板和干骺端胰岛素样生长因子－Ⅰ分布的研究

采用硬组织切片技术和ＡＢＣ免疫组织化学技术，对５例１６～２０周胎儿股骨骺板、干骺瑞进行胰岛素样生长因子－Ｉ（简称ＩＧＦ－Ｉ）的定位研究。观察到骺板储备区、增生区和肥大区均有ＩＧＦ－Ｉ免疫反应阳住的软骨细胞；干骺端存在一定数量的ＩＧＦ－Ｉ阳性成骨细胞，部分类骨质和骨基质也有阳性反应物沉积，少数破骨细胞也呈ＩＧＦ－Ｉ免疫阳性反应。作者同时讨论了在硬组织切片上进行免疫组化染色的可能性和ＩＧＦ－Ｉ在骨组织内的作用。     

骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究

目的 观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点，初步评价这一凝胶基质作为软骨组织构建材料的生物学性能。方法 将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养，行大体，倒置显微镜以及组织学，Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察。结果 骺板软骨细胞－生物凝胶复合的，在体外培养过程中不能春初始外形，培养1周直径可收缩为初始的45％，但能保持种子细胞的稳定均发布。经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织，表面为由1－3层梭形细胞组成的膜样结构，内部细胞主要为圆形细胞，有细胞外基质相隔，形成软骨细胞陷窝。基质中富含软骨特异性基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，而Ⅰ型胶原免疫组化逐渐转为弱阳性，位于表面膜结构。结论 这一生物凝胶具有良好的细胞相容性，适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨，但难以维持其初始外形。     

大鼠骨组织P物质与降钙素基因相关肽的分布及意义

目的 了解神经肽P物质（SP），降钙素基因相关肽（CGRP）在大鼠长骨组织中的存在与分布并探讨其在骨代谢中的意义。方法 对6只8wk龄SD大鼠股骨髁部切片行SP，CGRP免疫组化染色，确定不同部位免疫阳性物质的分布以及其在不同细胞内的基因表达。结果 SP，CGRP免疫阳性物质广泛分布于骨膜。生物板骨骺侧神经纤维呈CGRP强阳性染色，SP以及CGRP基因在骨髓基质细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞均呈阴性表达，CGRP基因在软骨细胞内呈阴性表达。骺板的肥大样软骨细胞强烈表达SP，对比之下静止期以及增殖期软骨细胞SP呈阴性表达。结论 CGRP免疫阳性神经纤维在骺侧生长板附近的分布以及生长板成熟软骨细胞S宾表达提示神经肽在长骨生长中起重要作用。     

姜黄素抑制硝普钠诱导的大鼠软骨细胞凋亡机制研究

目的 探讨姜黄素抑制硝普钠(SNP)诱导的大鼠软骨细胞凋亡的机制研究。 方法 每组取4只SD大鼠关节软骨，细胞进行原代培养，将软骨细胞分成6组，分别为空白对照组(A组)，SNP损伤组(B组)，SNP+5 μmol/L姜黄素组(C组)，SNP+10 μmol/L姜黄素组(D组)，SNP+20 μmol/L姜黄素组(E组),SNP+30 μmol/L姜黄素组(F组)。用CCK8法检测不同浓度的姜黄素对软骨细胞增殖的影响，同时检测各组中软骨细胞的活性；用RtPCR检测软骨细胞MMP-13、caspase-3、Bax和Bcl-2基因的表达情况；用Hoechst 33342染色观察软骨细胞核凋亡情况；Western Blotting检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况。 结果 ①当姜黄素的浓度为20 μmol/L时，姜黄素对软骨细胞的促增殖作用最为明显；②CCK8法检测各组细胞的活性率从大至小依次为A组＞E组＞D组＞C组＞F组＞B组；③RtPCR检测软骨细胞caspase-3、Bax和Bcl-2表达量经姜黄素处理后均有显著变化；④Hoechst 33342染色结果表明姜黄素能改善SNP诱导的软骨细胞核染色质的损伤，减少软骨细胞中的线粒体膜电位；⑤Western boltting检测各组软骨细胞中caspase-3、Bax、蛋白的表达情况，表达量依次为B组＞E组＞A组；Bcl-2蛋白的表达情况，表达量依次为A组＞E组＞B组。 结论 姜黄素通过抑制线粒体凋亡途径，从而减少SNP诱导的大鼠软骨细胞的凋亡。      

TGF-β诱导骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化

目的　通过研究转化生长因子 - β(TGF- β)对骺板软骨细胞分化的作用 ,揭示 TGF- β软骨内成骨的作用机制。方法　采用鸡胚股骨无血清培养、酶组化检测碱性磷酸酶 (AL P)、免疫组化检测 型胶原、纤维粘连蛋白 (FN)等方法 ,观察 TGF- β在不同作用时间和剂量时对骺板肥大区软骨细胞分化的作用。结果　 TGF- β可使肥大区软骨细胞表达 型胶原和 FN,使 AL P表达增加 ,并存在着量效和时效关系。结论　 TGF- β可以诱导鸡胚股骨骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化 ,与 TGF- β的作用剂量和时间密切相关。     

TGF—β诱导骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化

目的 通过研究转化生长因子－β（TGF－β）对骺板软骨细胞分化的作用,揭示TGF－β软骨内成骨的作用机制。方法 采用鸡胚股骨无血清培养、酶组化检测碱性磷酸酶（ALP）、免疫组化检测Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白（FN）等方法,观察TGF－β在不同作用时间和剂量时对骺板肥大区软骨细胞分化的作用。结果 TGF－β可使肥大区软骨细胞表达Ⅰ型胶原和FN,使ALP表达增加,并存在着量效和时效关系。结论 TGF－β可以诱导鸡胚股骨骺板肥大区软骨细胞向成骨样细胞分化,与TGF－β的作用剂量和时间密切相关。     

干骺端截骨延长引起骨骺板缩窄的超微结构观察

目的 :探讨干骺端截骨延长引起骨骺板缩窄的发生机理。方法 :选用 2 8只幼龄绵羊 ,按不同延长幅度建立干骺端截骨延长模型。通过透射电镜观察缩窄之骨骺板的超微结构变化。结果 :缩窄之骺板软骨细胞代谢活动低下 ,暗细胞较多。结论 :骨骺板病理转归特点主要受骺板软骨细胞代谢活动的影响 ,骨延长对骺板所产生的压应力将抑制骺板软骨细胞的代谢活动 ,使其缩窄。     

沉默信息调节因子2在人骨关节炎软骨组织及细胞中的表达

目的 检测沉默信息调节因子2(SIRT2)在人软骨中的表达,探讨其在骨关节炎(OA)与正常软骨组织及细胞中表达的差异性.方法 选取临床20例骨关节炎关节软骨,为OA组;另取10例正常关节软骨,为对照组.免疫荧光染色法检测SIRT2在两组软骨组织的表达分布及表达情况.分离软骨细胞并进行细胞传代培养,甲苯胺蓝染色进行细胞鉴定,Western blot法检测软骨组织及细胞中SIRT2的表达情况.结果 免疫荧光染色结果显示SIRT2表达于软骨组织中,分布在细胞核与细胞质中,OA组SIRT2阳性细胞率较对照组明显降低(P<0.01);Western blot结果显示OA组软骨组织中SIRT2表达显著低于对照组(P<0.01),软骨细胞中SIRT2的表达亦显著低于对照组(P<0.01).结论 SIRT2在人类软骨组织中有表达,具体表达在细胞核与细胞质中,SIRT2表达降低可能导致骨关节炎的发生及进展.     

Age-related Marrow Conversion and Developing Epiphysis in the Proximal Femur： Evaluation with STIR MR Imaging

In order to observe the feature of age-related marrow conversion and maturation of epiphyseal cartilage and analyze the distribution of red and yellow marrow in the proximal femur at STIR MR imaging,STIR and T1 weighted MR imaging of the proximal femur in 52 subjects,aged 4 months to 25 years old,were retrospectively analyzed for the distribution and appearance of red and yellow marrow.The subjects with no known bone marrow abnormalities were divided into 6 age groups.The signal intensity of the marrow in the proximal epiphysis,proximal metaphysis,proximal diaphysis,distal diaphysis and greater trochanter was compared with the signal intensity and homogeneity of surrounding muscle and fat and graded by two observers.The results showed that the conversion of hematopoietic marrow in the proximal femur followed a well-defined sequence,occurring first in the proximal epiphysis,followed by the distal diaphysis,and then greater trochanter and metaphysis.STIR in combination with T1-weighted imaging could display clearly the origin of ossification center and the course of conversion from red to yellow marrow in proximal epiphysis and greater trochanter.STIR imaging showed that the marrow conversion in proximal metaphysic began below epiphyseal plate and intertrochanter.The site of red yellow was distributed in weight-bearing axis by 20 years of age.The marrow conversion of diaphysis was from distal end to proximal end,and the consequence of conversion was that distal diaphysis contained yellow marrow but proximal diaphysis partly red marrow connected with the red marrow of metaphysic.The epiphyseal cartilage had different characters of signal-intensity with age in STIR sequence.The distribution of red marrow in STIR imaging was more close to that of anatomy than T1-weighted imaging.It was concluded that STIR could dynamically display the feature of morrow conversion and the development of epiphyseal cartilage and accurately reveal the age-related distribution of red and yellow marrow on STIR imaging in the proximal femur.     

可注射型骺板软骨水凝胶的制作及特性研究

目的 构建具有良好可塑性和生物特性的组织工程化骺软骨。 方法 制备胎牛骺软骨细胞外基质（cattlearticular cartilage extracellular matrix,CACECM）,复合藻酸钙（ 加10% 葡萄糖酸钙） 制备成可注射性水凝胶材料,行DNA 及糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG） 定量检测。再与体外扩增的2 周龄新西兰白兔第二代骺软骨细胞复合培养,并植于实验兔背部脊柱两旁皮下,8 周后取材进行形态学观察及组织学检测。 结果 制备的可注射型水凝胶材料有较好的生物性能,培养出的组织工程化骺软骨组织细胞生长良好,具有分泌软骨基质功能。 结论 将异体脱细胞骺软骨细胞外基质与藻酸钙及葡萄糖酸钙结合,可以作为良好的可注射型水凝胶材料应用于组织工程化骺软骨的构建。     

无血清培养骺板细胞分泌TGF-β1的实验研究

目的观察骺板细胞在无血清培养液中的生长情况,并通过ELISA方法检测骺板细胞分泌TGF-β1。方法提取3周龄新西兰兔骺板组织,获得良好生物活性的骺板细胞。采用CCK-8生长曲线检测骺板细胞在无血清培养液中的生长增殖情况,并通过ELISA方法检测骺板细胞分泌TGF-β1。结果骺板细胞生长情况良好,分泌细胞外基质。AO/PI荧光染色显示存活的骺板细胞呈亮绿色,周围散在有少量红染的死细胞。骺板细胞在DMEM培养液以及无血清培养液培养时生长曲线形态基本相似,在1、2d时细胞增殖缓慢,之后增殖速度逐渐增加,6-7d逐渐进入平台期。第1天时骺板细胞开始释放TGF-β1,然后释放量逐渐增加,第6d时浓度达到167.2pg/ml。结论骺板细胞在无血清培养液中增殖情况良好并能分泌TGF-β1。     

丁烯酸内酯诱导软骨细胞凋亡及其机制的研究

目的 研究丁烯酸内酯(BUT)致培养软骨细胞的凋亡损伤,探讨软骨细胞凋亡的机制及补硒对软骨细胞凋亡的保护作用.方法 体外单层及立体培养胎儿的软骨细胞.BUT毒素浓度分为0.1、1.0和5.0 μg/ml.脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记技术和Annexin V染色定性和定量检测软骨细胞凋亡.用多克隆抗体免疫组化检测细胞凋亡相关调控因子Bcl-2、Bax在培养软骨细胞中的表达.结果 BUT毒素可引起体外培养软骨细胞凋亡,且与BUT毒素浓度有一定关系.在0～1.0 mg/ml之间时,BUT毒素浓度越大,凋亡细胞数量越多;各毒素组培养软骨细胞Bcl-2、Bax的表达显著增高(P＜0.05);BUT毒素加硒组软骨细胞凋亡较毒素组明显减少(P＜0.05),而且凋亡调控因子Bcl-2、Bax表达阳性率较毒素组降低(P＜0.05).结论 BUT毒素可以引起体外培养的软骨细胞凋亡,且与BUT毒素浓度有一定关系,各毒素组Bcl-2、Bax蛋白表达增多.补硒对BUT毒素所致软骨细胞凋亡有一定的保护作用.     

大骨节病关节软骨细胞凋亡及其相关调控因子的表达

OBJECTIVE: To investigate the characteristics of chondrocyte apoptosis and distribution of Bcl-2, Bax, Fas and iNos expressions in articular cartilage in Kashin-Beck disease (KBD). METHODS: Samples of articular cartilage were collected from 15 healthy children and 15 children with KBD diagnosed according to the Pathological Criteria of KBD Diagnosis in China. Chondrocyte apoptosis was detected by TUNEL method, and the articular chondrocytes positive for Bcl-2, Bax, Fas and iNos were stained by B-SA immunohistochemistry. RESULTS: The percentage of apoptotic chondrocytes positively stained by TUNEL in the middle layer of articular cartilage was significantly higher in KBD children than in the control group (33.60%+/-2.71% vs 1.33%+/-0.41%, t=11.59, P<0.01). Significant difference in Bcl-2, Bax, Fas and iNos expressions was observed between the upper, middle and deep layers of the articular cartilage of KBD children (F =73.49-114.42, P<0.01), and staining for Bcl-2, Bax, Fas and iNos in KBD children was prominent in the upper layer (41.93%+/-12.26%, 45.60%+/-15.78%, 53.60%+/-16.49%, and 45.47%+/-14.02%, respectively) and the middle layer (14.93%+/-3.50%, 13.87%+/-4.32%, 23.27%+/-4.83%, and 21.67%+/-6.82%, respectively) of the articular cartilage; the percentages of chondrocytes positively stained for Bcl-2, Bax, Fas and iNos were significantly higher than those of the control group (t=11.75-18.65, P<0.01). CONCLUSION: The percentages of apoptotic chondrocytes and chondrocytes positive for Bcl-2, Bax, Fas and iNos in the articular cartilage of children with KBD are significantly higher than those in healthy children.