单核细胞趋化蛋白－1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％。趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

hIL—13融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞（ＨＰＢＭＣ）中扩增出的０．３ｋｂ的ｈＩＬ－１３基因片段，经ＤＮＡ重组技术，插入到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２中，转化入感受态的大肠杆菌ＴＧ１中，成功地构建了ｈＩＬ－１３的基因工程表达菌株ｈＩＬ－１３「ｐＧＥＸ－４Ｔ－２／ＴＧ１。经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后表达的ＧＳＴ－ＩＬ－１３融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明分子量约３６ｋＤ、     

A组轮状病毒外壳蛋白VP4的原核表达

选用原核表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ，该载体表达谷胱苷肽－Ｓ转移酶融合蛋白，将完整的Ａ组轮状病毒外壳蛋白基因插入ｐＥＧＸ２Ｔ中，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上没有明显的表达条带，而将部分ＶＰ４基因和６３１个碱基，插入ｐＧＥＸ２Ｔ，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中有明显的表达条带。     

抗人CD4单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现的一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｖＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性。     

抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｃＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，光密度扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证表达产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，Ｅ６ＳｃＦｖ表达产物约为５２ｋｕ左右，与预期的结果相符；光密度扫描结果表明，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白占菌体总蛋白的４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实，在相应分子量处，有ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的显色印迹；进一步对表达产物的形式分析，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的表达产物为包涵体形式。结论：在大肠杆菌中成功地表达了抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因与谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）基因的融合蛋白     

人单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）基因的PCR扩增、克隆及序列分析

本文报道用植物血凝素（ＰＨＡ）诱导健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ，包括单核细胞和淋巴细胞），提取细胞总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ第一链，再以其为模板进行ＰＣＲ，得到了编码成熟单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切后，回收含ＭＣＰ－１基因的长约２８０ｂｐ的ＤＮＡ片段，插入到经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切的ｐＵＣ１９载体中，进行序列分析。结果表明，ＭＣＰ－１中第１２个氨基酸的编码序列与国外报道的不同。由ＴＧＴ变成了ＴＧＣ，但编码相同的氨基酸即半胱氨酸，其余的编码序列则完全相同，说明ＭＣＰ－１的基因型可能存在着多态性。     

人单核细胞趋化蛋白—15‘端翻译起始区的改构及其表达

应用ＰＣＲ技术优化人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）基因的５‘端翻译起始区，并半其亚克隆入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中，经ＤＮＡ测序证实优化成功，且在大肠杆菌中表达出ＭＣＰ－１蛋白，表达产物的占菌体总蛋白的１０％左右，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明，表达产物可与ＭＣＰ－１抗体发生特异性反应。     

人单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）cDNA的克隆和序列测定

人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）是由多种细胞产生的一种趋化因子。它不但能趋化单核细胞还能激活单核细胞，在机体防御、炎症恢复和抗肿瘤等方面起重要作用。本文利用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＭＣＰ－１ｃＤＮＡ，经核苷酸序列测定，除第１２位密码子为ＴＧＴ与国外报道的ＴＧＣ不同、但编码相同的氨基酸半胱氨酸外，其余序列完全相同。     

人单核细胞趋化蛋白—1（MCP—1）cDNA的克隆和序列测定

人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）是由多种细胞产生的一种趋化因子。它不但能趋化单核细胞还能激活单核细胞，在机体防御。炎症恢复和抗肿瘤等方面起重要作用。本文利用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＭＣＰ－１ｃＤＮＡ，经核鞋酸序列测定，除第１２位密码子为ＴＧＴ与国外报道的ＴＧＣ不同，但编码相同的氨基酸半胱氨酸外，其余序列完全相同。     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

氧化修饰的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白对单核细胞MCP-1表达的影响

为了研究氧化修饰的低密度脂蛋白（ＯＸ┐ＬＤＬ）和氧化修饰的极低密度脂蛋白（ＯＸ┐ＶＬＤＬ）对单核细胞的单核细胞趋化蛋白１（ＭＣＰ┐１）ｍＲＮＡ和蛋白表达的影响。在单核细胞的培养基中分别加入２５μｇ／ｍｌ的ＬＤＬ、ＯＸ┐ＬＤＬ、ＶＬＤＬ和ＯＸ┐ＶＬＤＬ，培养２４小时后分别收集单核细胞及其条件培养基。参照异硫氰酸胍法提取单核细胞总ＲＮＡ，并用γ３２Ｐ末端标记ＭＣＰ┐１寡核苷酸探针，进行ｓｌｏｔｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。同时用夹心ＥＬＩＳＡ检测其条件培养基中ＭＣＰ┐１蛋白含量。结果显示单核细胞能表达ＭＣＰ┐１，ＯＸ┐ＬＤＬ和ＯＸ┐ＶＬＤＬ能明显增强单核细胞表达ＭＣＰ┐１。而ＬＤＬ和ＶＬＤＬ的作用却很轻微。说明单核细胞能通过表达ＭＣＰ┐１，从而进一步招引其它的单核细胞迁入内皮下间隙，而ＯＸ┐ＬＤＬ和ＯＸ┐ＶＬＤＬ能加强这种作用。     

hIL-15成熟肽段基因的克隆及其原核表达载体的构建

本文采用ＲＴ ＰＣＲ的方法自成人脾脏中扩增出ｈＩＬ １５成熟肽段基因，定向克隆入ｐＵＣ１９中，筛选带有插段的阳性克隆。经序列测定证实后，插入大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ １中，构建重组表达质粒ｐＧＩＬ １５。ＳＤＳ ＰＡＧＥ证实ｐＧＩＬ １５大肠杆菌中可表达分子量为３８６ｋＤ的融合蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的１８５％。目的蛋白经纯化后具有促进靶细胞ＤＮＡ合成的作用。     

MCP-1的表达与动脉粥样硬化

单核细胞趋化蛋白１（ＭＣＰ－１）能趋化单核细胞在内皮下间隙聚集，这是动脉粥样硬化最早期的病变之一，近年研究表明，内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞和巨噬细胞均能表达ＭＣＰ－１。并认为动脉粥样硬化病变早期的内皮细胞和内皮下巨噬细胞是ＭＣＰ－１的主要来源。     

CD44H胞外区cDNA片段的克隆及在大肠杆菌中的表达

以ｐＵＣ／ＣＤ４４为模板，用ＰＣＲ法扩增出Ｈ型ＣＤ４４的ｃＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲＩ／ＢｃＩＩ双酶切保留编码ＣＤ４４Ｈ的信号肽及胞外内ＤＮＡ片段，插入融合蛋白表达载体ＰＥＸ３１ｂ的ＥｃｏＲＩ／Ｓａ１Ｉ位点，形成重组质粒ＰＥＸ－ＣＤ４４，将ＰＥＸ－ＣＤ４４导入大肠杆菌菌ＲＲ１（ＰＣＩ８５７），经４２℃温控诱导，有额外蛋白的产生，分子量与预期大小一致，表达产物形成包涵体，表达产量占菌体总蛋白的２１％左右     

抗骨形成蛋白（BMP）单链抗体的构建

从一株鼠抗ＢＭＰ单克隆抗体杂交瘤中扩增出其可变区基因片段，并将其分别克隆入ＰＵＣ１８、１９载体，利用双脱氧链终止法进行序列测定和计算机分析后，应用一段人工合成的含１５个氨基酸的连接肽，将重链基因的Ｃ端和轻链基因的Ｎ端连接起来，构建成单链抗体。将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，在大肠杆菌ＪＭ１０９中获得初步表达。     

HIV-1核心蛋白p24在大肠杆菌中的表达与纯化

探索进一步提高ＨＩＶ－１Ｐ２４ｇａｇ蛋白在大肠杆菌中的表达效率,增加产物的纯化手段。方法：通过改造原核表达载体ＰＢＶ２２０和ｐＥＴ２８,构建了一种通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５,将ＨＩＶ－１ｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列,插入到ｐＶＶ５ｂ和ｐＥＴ２８ｂ的相应位点中,构建了重组表达质粒,ｐＥＧ１ｂ和ｐＥＧ７ｂ,转化到大肠杆菌中进行表达,产物利用ＩＭＡＣ金属螯合层析柱进行纯经,纯化的表达产物用     

寻常性天疱疮抗原EC1-2和EC3-4表位的分子克隆与蛋白表达

目的：克隆并表达寻常性天疱疮抗原（ＰＶＡ,即桥粒芯糖蛋白－３）的ＥＣ１－２和ＥＣ３－４表位,用于通过血清学方法特异性诊断天疱疮和了解ＰＶＡ的表位与抗ＰＶＡ抗体间的联系。方法：从角朊细胞抽提ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡ,扩增目的基因ＥＣ１－２和ＥＣ３－４后与质粒载体ＰＧＥＸ－４Ｔ－１连接,电转导入大肠杆菌ＢＬ２１,经ＩＰＴＧ诱导后表达ＥＣ１－２和ＥＣ３－４融合蛋白,ＳＤＳ－ＰＳＧＥ电泳后转移至硝酸纤素     

pS2融合蛋白的原核表达及其性质鉴定

目的：获得ｐＳ２融合蛋白。方法：ＲＴ－ＰＣＲ法从乳腺癌组织中扩增ｐＳ２片段，定向克隆到ＰＭＳ－３１ｂ载体上，重组质粒ＰＭＳ－ｐＳ２转化温度敏感型细菌ＰＯＰ２１３６，使之高效表达融合蛋白ＭＳ２－ｐＳ２。结果：免疫组织化学试验（ＩＨＣ）结果表明：纯化的融合蛋白ＭＳ２－ｐＳ２能与抗ｐＳ２进口单抗特异反应。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ试验表明；ＭＳ２－ｐＳ２能与ｐＳ２Ｃ端