β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV－2）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ＰＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））ＬａｃＺ基因表达的动态变化特点是，转染后表达较早（１２～２４ｈ）出现，并迅速达到高峰值（经２４ｈ），随后较快下降（经４８～７２ｈ）并维持在较低水平。将启动子附近ｉｔｒ结构有差别的上述两载体转染宿主细胞７２ｈ后做表达水平比较，结果ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）在２９３细胞和Ａ５４９细胞中，ＬａｃＺ表达水平均高于ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）（１．２倍～１．４倍），提示启动子附近ＡＡＶｉｔｒ结构的变异对表达有一定的影响。     

《细胞与分子免疫学杂志》（季刊）1996年第12卷目录索引

《细胞与分子免疫学杂志》（季刊）１９９６年第１２卷目录索引β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达（正文见第１１页）图１重组ＡＡＶ表达载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）的构...     

Epstein—Barr病毒膜抗原在昆虫细胞sf9中的表达,纯 …

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（ＥＢ）病毒膜抗原基因（ＥＢＶ－ＭＡ）称ＭＡ１和截去穿膜区的ＭＡ基因称ＭＡ２分别插入杆状病毒表达载体ｐＶＬ－９４１。将两种重组质粒分别与杆状病毒ＤＮＡ共转染ｓｆ９细胞后获得Ｂａｃｕｌｏ－ＭＡ１和Ｂａｃｕｌｏ－ＭＡ２两种重组病毒，表达产物分别位于重组病毒感染的细胞表面或释放到细胞培养液中。免疫荧光方法检查，在感染的细胞表面表达产物与抗ＭＡ的单克隆抗体特异性地结合，ＳＤＳ－Ｐ     

通用型腺病毒伴随病毒载体的构建

目的构建含腺病毒伴随病毒（ＡＡＶ）基因组两端的反向重复序列（ＩＴＲｓ）和表达必须元件如启动子、多克隆位点和ＰｏｌｙＡ信号的通用型载体质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ，并获得重组ＡＡＶ（ｒＶＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ）。方法通过ＤＮＡ重组技术，将ＳＶ４０ＰｏｌｙＡ、Ｎｅｏ基因、ＣＭＶ－ＩＥ启动子和多克隆位点组成表达盒子，取代含ＡＡＶ全基因组质粒ｐＳＳＶ９中ＡＡＶ结构基因部分，构建成质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ。用ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染５型腺病毒（Ａｄ５）感染的重组ＡＡＶ包装细胞系ＡＥ１２０１，能获得重组病毒ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ。提取ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ感染细胞的染色体，用Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析重组病毒基因组在感染细胞中的存在情况。结果质粒ｐＡＣＲ－Ｎｅｏ转染包装细胞系后所得ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ滴度为４．２×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，并且ｒＡＡＶ／ＡＣＲ－Ｎｅｏ能在转导细胞内实现其基因组与细胞染色体的整合。结论成功地构建了通用型ＡＡＶ载体，为今后的ＡＡＶ载体研究、基因治疗和临床应用打下了基础     

IL-2重组逆转录病毒载体的构建及介导的肝癌特异性基因治疗研究

将小鼠白细胞介素２（ｍＩＬ－２）ｃＤＮＡ全序列克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，使其转录受ＳＶ４０早期启动子驱动，构建ｐＭＮＳＭ－ＳＶ４０－ｍＩＬ－２。用小鼠白蛋白增强子／启动子（Ａｌｂｅ／ｐ）置换ｐＭＮＳＭ－ＳＶ４０－ｍＩＬ－２中ＳＶ４０启动子，构建ｐＭＮＳＭ－Ａｌｂｅ／ｐ－ｍＩＬ－２。经酶切鉴定符合要求。将重组体用磷酸钙共沉淀法导人逆转录病毒包装细胞ｐＡ３１７中，用所得的重组病毒在８μｇ／ｍｌＰｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下体外感染小鼠肝癌细胞（ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ、ＢＮＬＩＭＥ）、黑色素瘤…     

恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步 …

目的 探索恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗的可行性。方法 把带有ＡＴＧ的接头与人工合成的恶性疟原虫复合多价抗原基因ＡＢ相连后，构建分别带有ＳＶ４０或ＲＳＶ启动子的真核表达载体ｐＳＶ／２ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ，重组表达质粒经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，检测其诱发特异性体液和细胞免疫应答水平及毒副作用。结果 ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后均诱发了一定水平的细胞及体液免疫应答，带ＲＳ     

恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步研究

目的探索恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗的可行性。方法把带有ＡＴＧ的接头与人工合成的恶性疟原虫复合多价抗原基因ＡＢ相连后，构建分别带有ＳＶ４０或ＲＳＶ启动子的真核表达载体ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ，重组表达质粒经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后，检测其诱发特异性体液和细胞免疫应答水平及毒副作用。结果ｐＳＶ２／ＡＢ及ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后均诱发了一定水平的细胞及体液免疫应答，带ＲＳＶ启动子的ｐＲＥＰ９／ＡＢ免疫原性略强于带ＳＶ４０启动子的ｐＳＶ２／ＡＢ，ＤＮＡ免疫后未见明显的毒副作用。结论恶性疟复合多价ＤＮＡ疫苗可诱发特异的免疫应答，为疟疾ＤＮＡ疫苗的研究提供了一定的理论及实验依据     

弓形虫P30基因在昆虫杆状病毒载体体系中的初步表达

将弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）基因插入转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后将重组质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｐ３０ＤＮＡ与粉纹夜蛾核形多角体病毒ＴｎＮＰＶＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞（Ｓｆ），通过同源重组和空斑纯化，得到重组病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０．对重组病毒感染的Ｓｆ细胞及银纹夜蛾幼虫进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示：Ｐ３０基因在Ｓｆ细胞及虫体中得到了表达，表达产物具有特异的免疫反应性。     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

用细菌／杆状病毒系统在昆虫细胞中表达HIV—2外膜糖蛋白gp105和跨膜糖蛋白g

目的 用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统在昆虫细胞Ｓｆ９中表达ＨＩＶ－２外膜糖蛋白ｇｐ１０５跨膜糖蛋白ｇｐ３６,为研制艾滋病疫苗和诊断试剂奠定基础。方法 分别将ＨＩＶ－２外膜蛋白ｇｐ１０５和跨膜蛋白ｇｐ３６全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＴＨａ和ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＴＨｂ中我角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＨＴａ－ｐｇ１０５和ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＨＴｂ－ｇｐ３６,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达ＨＩＶ－２的ｇｐ１０５和ｇｐ３６。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,ｐｇ１０５基因表达产物为－６６０００ｕ糖蛋白,ｐｇ３６基因则表达－４１０００ｕ糖蛋白,与天然产物一致。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示：     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

外源性微卫星序列转染RER+细胞株观察肿瘤细胞遗传不稳定性的研究

目的利用ＲＥＲ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｒｒｏｒ）表型的人肿瘤细胞株，在体外观察肿瘤细胞微卫星序列（ＭＳ）频发突变，研究人类肿瘤细胞基因组ＤＮＡ的遗传不稳定性。方法把含有人工合成的简单重复序列（ＣＡ）１４和ＬａｃＺ标志基因的重组质粒ｐＣＭＶ－ＣＡＲ经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ方法转染ＲＥＲ＋或ＲＥＲ－人结肠癌细胞株。（ＣＡ）１４插入ＬａｃＺ编码序列之中，干扰了ＬａｃＺ基因的正确读码。当（ＣＡ）１４序列发生碱基缺失或插入突变，碱基数变为３的倍数时ＬａｃＺ基因读码框恢复，表达产生有生物活性的β－半乳糖苷酶。后者通过Ｘ－ｇａｌ染色检出。结果转染ｐＣＭＶ－ＣＡＲ的细胞克隆经Ｈｙｇｒｏｍｉｃｉｎ筛选并建株培养，观察到部份ＲＥＲ＋的质粒转染克隆，ＬａｃＺ能正确读码表达，经Ｘ－ｇａｌ染色试验，细胞变蓝。蓝细胞在建株培养后的传代过程中持续存在。而ＲＥＲ－细胞株，ｐＣＭＶ－ＣＡＲ转染克隆用Ｘ－ｇａｌ染色未见任何蓝色细胞。结论外源性（ＣＡ）１４序列在ＲＥＲ＋细胞转染克隆中可以发生碱基丢失或插入突变。直接反映了肿瘤细胞ＤＮＡ的不稳定性和复杂的突变状态。并提示外源性（ＣＡ）１４可为研究环境因素对人体肿瘤ＤＮＡ突变影响提供直接的观察指标     

应用痘苗病毒载体表达猴轮状病毒VP4抗原基因

把编码猴轮状病毒（Ｒｈｅｓｕｓｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＲＶ）Ｖｐ４抗原的第４基因片段插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｐ７．５启动子下游，构建成在痘苗病毒Ｐ７．５启动子调控下表达猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因的重组质粒ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４。应用磷酸钙沉淀技术将ＰＪＳＡ１１７５－ＶＰ４ＤＮＡ转入ＴＫ－１４３细胞，在ＢＵＤＲ和Ｘ－ｇａｌ存在下筛选蓝色蚀斑。经３代以上纯化和病毒增殖，获重组病毒Ｒ－ＶＪＳＡ１１７５－Ｖｐ４。蚀斑滴定其满度达到１５×１０１１ＰＦＵ／Ｌ。经核酸杂交试验证明所获得的重组痘苗病毒带有猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因。用重组病毒感染ＴＫ－１４３细胞（或Ｖｅｒｏ细胞），在感染后４８ｈ，用酶免疫法（ＥＩＡ）检测受染细胞上清液和细胞裂解液中表达的猴轮状病毒Ｖｐ４抗原基因均呈阳性反应。本试验为本研究室轮状病毒基因工程疫苗的一部分，为深入了解轮状病毒基因结构及其功能在方法学上奠定了必要的基础。     

含日本脑炎病毒pre—M／E蛋白基因真核表达质粒的构建及…

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时，大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击中特异性抗体的产生。     

多源性微卫星序列转染RER^＋细胞株观察肿瘤细胞遗传不稳…

目的 利用ＲＥＲ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｒｒｏｒ）表型的人肿瘤细胞株，在体外观察肿瘤细胞微卫星序列（ＭＳ）频发突变，研究了人类肿瘤细胞基因组ＤＮＡ遗传不稳定性。方法 把含有人工合成的简单重复序列（ＣＡ）１４和ＬａｃＺ标志基因的重组质粒ｐＣＭＶ－ＣＡＲ经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ方法转染ＲＥＲ＾＋或ＲＥＲ＾－人结肠癌 。（ＣＡ）１４插入ＬａｃＺ编码序列之中，干扰了ＬａｃＺ基因的正确读码。当（ＣＡ）１４     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗株的建立

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（ＰＣＲ）修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７５Ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＋痘苗病毒天坛７６１株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（３２Ｐ－ＨＳＶ－２ｇＤ）原位杂交法和３轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，ＨＳＶ－２ｇＤ基因已插入痘苗病毒基因组内预期的ＴＫ区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白。     

HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免？…

目的 构建ＨＳＶ－１型ＳＭ４４株糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨ＨＳＶ－１ ｇＤ基因作为基因疫苗的可能性。方法 从ＨＳＶ－１基因组中扩增ｇＤ的全编码基因,克隆入载体ｐＵＣ１９中,测序鉴定后转入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。所得重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ－ｇＤ以电穿孔法转染ＣＨＯ细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用ｐｃＤＮＡ－ｇＤ免疫小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测基因免疫     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。     

蓝舌病毒两外壳蛋白VP2和VP5在昆虫细胞中的表达 …

目的 研究蓝舌病毒（ＢＴＶ）ＶＰ２与ＶＰ５的免疫学特性,为ＢＴＶ基因工程疫苗研究和病毒样颗粒装配打下基础。方法 将ＢＴＶ１０ ＶＰ２和ＶＰ５基因分别插入杆状病毒表达载体ｐＦａｓｔＢａｃ１,转染昆虫细胞获得重组杆状病毒。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测重组杆状病毒对ＶＰ２和ＶＰ５的表达,运用组织培养中和试验和直接血凝试验检测表达产物的生物学活性。