应用SEREX技术筛选肿瘤抗原的研究进展

SEREX (serologicalidentificationofantigenbyrecombi nantcDNAexpressionlibraries)技术 ,即重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术 ,是由德国血清学家Sahin等[1] 建立的从分子水平鉴定肿瘤抗原的方法。其理论基础是肿瘤能刺激机体产生免疫反应 ,人体B淋巴细胞可以识别自身肿瘤抗原 ,产生高价抗体 ,引起强烈的IgG反应。SEREX技术不需要特异CTL和瘤细胞的体外建株 ,而是应用cDNA表达文库使抗原浓度成百倍的增高 ,解决了既往肿瘤抗原抗体反应中的关键问题 ,新发现了大量肿瘤抗原。1　SEREX技术SEREX技术的基本步骤[1,2 ] :①患者…     

SEREX技术筛选及鉴定食管癌肿瘤抗原

背景与目的:正常细胞向癌细胞转化过程中,突变的基因或各种异常表达的蛋白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反应,因此肿瘤患者的血清中存在着与肿瘤相关的自身抗体.重组cDNA表达文库血清学分析法(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX)是利用肿瘤患者血清中的自身抗体筛选、鉴定肿瘤抗原的技术.本研究拟采用SEREX的方法寻找食管癌自身抗体的相关肿瘤抗原,鉴定与食管癌发生、发展相关的基因和免疫治疗分子靶点,并为食管癌的诊断提供候选血清标志物.方法:用食管癌组织建立库容量达1.6×106 pfu的cDNA表达文库,SEREX筛选获得21个不同cDNA序列的阳性克隆,进一步使用SADA法分析其中4个抗原在10例食管癌及10例正常人血清中的反应.结果:在Homosapiens desmin(DES)等21个阳性克隆中,4个克隆与已知EST序列明显无同源性,另外17个克隆与已知基因高度同源.Ribosomal protein S4等4个抗原与食管癌患者和正常人血清反应阳性率分别为40%和0%、60%和10%、70%和20%、30%和20%.结论:Ribosomal protein S4等4个抗原普遍参与了食管癌患者的体液免疫反应,与食管癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清.本研究发现的21个食管癌抗原可作为食管癌治疗的潜在分子靶点和食管癌诊断新的候选血清学标志物.     

应用蛋白印迹-免疫沉淀-质谱法筛选卵巢癌肿瘤抗原

背景与目的肿瘤抗原的筛选对卵巢癌的早期诊断有重要意义。目前,噬菌体抗体库技术(phageantibodylibrary)、核糖体展示技术(ribosomedisplay)和血清学筛选重组cDNA表达文库(serologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibraries,SEREX)技术等作为常用的肿瘤抗原筛选方法已得到广泛应用。本研究采用蛋白印迹鄄免疫沉淀鄄质谱方法筛选和鉴定卵巢癌肿瘤抗原,以期建立一种新的筛选肿瘤抗原的方法及技术路线。方法应用蛋白印迹(Westernblot)法筛选出差异明显的卵巢癌患者血清,用该血清与SKOV3细胞裂解物反应,免疫沉淀富集抗原,与正常血清的免疫沉淀样品比较,获得差异蛋白条带,然后进行质谱鉴定、生物信息学分析。结果采用蛋白印迹筛选到标记为7号的卵巢癌患者血清,与其他血清比较有明显的差异,经免疫沉淀、聚丙烯酰胺凝胶电泳与正常血清免疫沉淀样品比较,发现在接近66.2ku的位置处有一差异蛋白条带,经质谱鉴定、生物信息学分析为热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70及细胞角蛋白(cytokeratin)9。结论采用蛋白印迹鄄免疫沉淀鄄质谱法进行卵巢癌肿瘤抗原的筛选和鉴定是一种行之有效的方法。     

应用SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原

背景与目的 目前用于非小细胞肺癌诊断的标志物为数不多,为寻找更多的早期诊断和靶向治疗相关的标志物,本研究应用SEREX技术筛选与鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原.方法 使用非小细胞肺癌患者血清对人肺鳞癌和腺癌噬菌体展示文库进行生物淘选和SEREX筛选.PCR扩增阳性克隆插入片段后测序,结果 与GeneBank数据库中已知基因进行同源性比较,分析其生物学特性.结果用非小细胞肺癌血清对噬菌体展示文库进行筛选,共获得31个阳性克隆,测序后发现其代表15个基因,其中12个与已知cDNA序列同源,与肺癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另外3个未发现有同源基因,可能是新基因.结论 应用SEREX技术发现15个肺癌相关抗原和3个肺癌相关抗原的候选基因,为进一步的深入研究打下良好的基础.     

噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或scFv,这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别,前提条件是能得到抗原纯品,对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用,所以又出现全细胞筛选,直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选,无需纯抗原,但目标抗原一定要有较高的表达水平,对于表达较低的情况,一种策略是先利用正常细胞筛选,去掉无关抗原后,再利用肿瘤细胞筛选;另一种策略是细胞内化筛选,特异性抗体被内化入细胞,然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞,获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等,适用面较窄,未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测:转化数,即被感染的噬菌体数,它随筛选轮数的增加而增加;抗体基因插入载体的频率,高比例的丢失意味着筛选的低效率;抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点,如细胞融合、动物免疫等,目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用。     

噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或SCFV，这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别，前提条件是能得到抗原纯品，对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用，所以又出现全细胞筛选，直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选，无需纯抗原，但目标抗原一定要有较高的表达水平，对于表达较低的情况，一种策略是先利用正常细胞筛选，去掉无关抗原后，再利用肿瘤细胞筛选；另一种策略是细胞内化筛选，特异性抗体被内化入细胞，然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞，获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等，适用面较窄，未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测：转化数，即被感染的噬菌体数，它随筛选轮数的增加而增加；抗体基因插入栽体的频率，高比例的丢失意味着筛选的低效率；抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点，如细胞融合、动物免疫等，目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用，     

KDR基因重组的T7噬菌体疫苗构建及其对小鼠Lewis肺癌抑制作用的研究

目的：构建KDR基因重组的T7噬菌体疫苗以及探讨其对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用。方法：克隆KDR的膜外Ⅱ区基因,构建KDR基因重组T7噬菌体疫苗,免疫小鼠,免疫四次后接种Lewis肺癌,观察肿瘤的生长情况,14 d后脱颈椎杀死小鼠,眼球取血、取出瘤体称重,计算抑瘤率,观察抗肿瘤效果。ELISA检测小鼠血清抗KDR抗体滴度。结果：实验组抑制程度明显,肿瘤生长速度最慢,肿瘤重量与生理盐水组和空白噬菌体组相比有统计学差异(P＜0．05),抑瘤率可达57．0%,远大于空白噬菌体组(16．0%)。小鼠血清稀释至1∶500,小鼠特异性抗人源KDR抗体仍呈阳性。结论：KDR基因重组的T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌具有明显的抗肿瘤作用,用人源KDR作为免疫原免疫小鼠通过免疫交叉反应可以打破对自身抗原的免疫耐受,产生特异性的免疫反应。     

血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体肿瘤疫苗的免疫活性

目的:采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗诱导小鼠产生特异性抗体的免疫活性。方法:将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b-VEGF噬菌体疫苗。将疫苗免疫C57BL/6J小鼠。免疫4周后,用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度。结果:疫苗组血清产生较高水平抗VEGF抗体。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可打破机体对自身VEGF的免疫耐受,诱导产生较高水平的特异性抗VEGF抗体。     

EID3基因在大肠癌传代细胞mRNA的表达及其克隆

目的研究新的大肠癌相关性抗原EID3基因的克隆及其诊断价值。方法用SEREX技术筛选睾丸组织cDNA噬菌体表达文库,发现了一类似于肿瘤抑制基因（E1A基因）的EID3基因（NM_001008394.1）,构建原核表达载体pET32k-EID3,IPTG诱导重组EID3蛋白质的表达,并利用Ni NTA His Bind树脂纯化该重组蛋白质。用RT-PCR技术研究EID3mRNA在正常组织和大肠癌传代细胞的表达。结果经PCR扩增成功获得1002bp的人EID3基因,测序正确。在大肠杆菌中目的蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的10%,SDS-PAGE及Western blot分析显示,其相对分子质量为39000KD,纯化后的6xHisEID3纯度可达92%。通过RT-PCR分析发现,EID3基因在43例大肠癌传代细胞株中有39例阳性,阳性率为90.7%。在正常组织中,除睾丸组织不表达或有极低水平转录外,余均不表达。结论 EID3基因克隆、表达及纯化的成功,为其今后的肿瘤诊断和肿瘤多肽疫苗治疗研究奠定了基础。EID3m RNA表达检测用于诊断大肠癌,可能具有高特异性和高敏感性的特点。EID3蛋白在大肠癌患者中能够诱导机体的抗体免疫应答,可能成为一个新的大肠癌相关性抗原分子,其用于诊断大肠癌的可行性,有待进一步深入研究。     

结肠癌肿瘤自身抗体谱筛选及其应用

 目的 本研究拟寻找鉴定结肠癌自身抗体谱，研究这些自身抗体作为结肠癌诊断候选血清标志物的可能性，同时鉴定这些自身抗体的抗原为研究结肠癌发生、发展相关的基因提供线索。方法 用结肠癌组织建立了库容量达5×105pfu的cDNA表达文库，用结肠癌患者血清进行了文库血清学分析（SEREX），筛选获得了阳性抗原克隆，进一步分析了其中4个克隆与30例结肠癌和30例正常人血清的反应情况。结果 获得的33个阳性克隆中，31个剪切成功，2个克隆与已知EST序列明显无同源性，另外29个克隆与已知基因高度同源。Uracil DNA glycosylase等4个抗原克隆与结肠癌患者和正常人血清反应阳性率分别为76%（23%）、80%（6%）、77%（0）、73%（66%）。结论 本研究发现的29个结肠癌抗原可能参与了结肠癌的发生发展，可能作为结肠癌的治疗潜在分子靶点和结肠癌诊断新的候选血清学标志物。Uracil DNA glycosylase等3个克隆与结肠癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清，其相关自身抗体可作为结肠癌诊断的血清标志物。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。