多基因联合提高结直肠癌甲基化检测阳性率的研究

目的探讨联合检测Vimentin、sFRP1和HPP1基因甲基化对提高结直肠癌甲基化阳性率的意义。方法收集90例结直肠癌（结直肠癌组）和60例腺瘤性息肉（腺瘤组）患者及20例结直肠正常组织（正常对照组）标本,提取组织标本的DNA,采用甲基化特异性PCR（MSP）检测Vimentin、sFRP1和HPP1基因甲基化状态。分析其与结直肠癌的关系及甲基化阳性率。结果结直肠癌组Vimentin、sFRP1和HPP1基因甲基化率分别为66．7％（60／90）、68．9％（62／90）和72．2％（65／90）;腺瘤组则分别为53.3％（32／60）、55．0％（33／60）和50．0％（30／60）;正常对照组分别为0、0和5．0％（1／20）。结直肠癌组3个基因甲基化阳性率均高于腺瘤组和正常对照组（P〈O．05）。3个基因甲基化联合检测诊断结直肠癌和腺瘤的阳性率分别为93．3％（84／90）和76．7％（46／60）,高于单个基因检测的甲基化阳性率（P〈0．05）。3个基因甲基化状态与本组结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、远处转移及TNM分期无关（P〉0．05）。结论Vimentin、sFRP1和HPP1基因启动子甲基化水平在结直肠癌组织中升高．其联合检测明显提高了结直肠癌甲基化检测阳性率．有可能成为结直肠癌早期诊断的甲基化检测方案。     

微卫星不稳定结直肠癌hMLH1和hMSH2及hMSH6种系突变与hMLH1启动子甲基化检测

目的探究微卫星不稳定（MSI）结直肠癌患者的hMLH1、hMSH2和hMSH6种系突变特征和hMLH1启动子甲基化状态。方法对前瞻性收集的34例MSI结直肠癌患者检测其hMLH1、hMSH2和hMSH6种系突变，并研究其肿瘤的hMLH1启动子甲基化状态。结果34例MSI结直肠癌中。共检测到MLH1基因启动子的甲基化19例（55．9％）。19例MSI—H结直肠癌中检测到MLH1基因的甲基化14例（73．7％）；15例MSI—L结直肠癌检测到MLH1基因的甲基化5例（33．3％）；两组差异有统计学意义（P〈0．05）。全组共发现8个hMSH2和hMSH6基因的突变，其中hMSH6基因突变3个，hMSH2基因突变5个。结论中国人MSI结直肠癌错配修复基因突变（未测到MLH1基因突变）和MLH1基因启动子的甲基化检出率可能有别于国外MSI结直肠癌。     

肝癌抑癌基因GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A异常甲基化检测及其临床意义

目的 研究肝细胞癌中的GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A 4种基因启动子区域甲基化状态的表达差异,并探讨其在肝癌发生中的作用.方法运用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR,MSP）技术,分别检测35例肝癌组织及其相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中4种候选抑癌基因（GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A）启动子区域的甲基化表达情况,并结合临床病理资料进行分析.结果在肝细胞癌、癌旁及正常对照肝组织中检测到GSTP1基因启动子区的甲基化率分别是57.1 （20/35）,25.7％（9/35）,0％ （0/20）;p16基因启动子区甲基化率分别是54.3％ （19/35）,37.1％ （13/35）,0％ （0/20）; RIZ1基因启动子区甲基化率分别是68.6％ （24/35）,14.3％ （5/35）,0％ （0/20）;RASSF1A基因启动子区甲基化率分别是88.6％ （31/35）,74.3％（26/35）,10％ （2/20）,其中癌组织中GSTP1和RIZ1基因甲基化率均显著高于相应的癌旁组（P＜0.01）和正常对照肝组织（P＜0.01）,癌组织中p16、RASSF1A启动子区甲基化率高于癌旁组织,但二者无统计学意义（P＞0.05）,但明显高于正常对照肝组织（P＜ 0.01）.在肝癌组织中肿瘤有包膜侵犯者GSTP1基因甲基化阳性率明显高于无包膜侵犯者（P＜0.05）;乙肝表面抗原（HbsAg）阳性的肝癌患者p16基因甲基化阳性的比率要显著高于HbsAg阴性者（P＜0.05）;而RIZ1、RASSF1A与临床病理资料间均没有统计学意义（P＞ 0.05）.结论RIZ1、GSTP1基因甲基化状态具有肝癌特异性,或可作为临床肝癌辅助诊断的分子标记物.慢性HBV感染可能是导致p16甲基化而失活的原因,GSTP1基因启动子甲基化可能与肝细胞癌的侵袭性有关.     

粪便基因甲基化检测在结直肠癌及其癌前病变筛查中的作用

目的 探讨粪便中T淋巴细胞成熟相关蛋白（MAL）、细胞周期依赖性激酶抑制因子2A（CDKN2A）和6-氧-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因甲基化状态及其在结直肠癌和癌前病变筛查中的价值.方法 收集69例结直肠癌、24例腺瘤、19例增生性息肉患者及26名健康人群的清晨粪便标本,提取其DNA并进行亚硫酸氢盐修饰处理,采用甲基化特异性PCR技术分析MAL、CDKN2A及MGMT甲基化状态,分析其与结直肠癌临床病理特征的关系,并比较3个基因甲基化联合检测与粪隐血试验（FOBT）的诊断敏感性.结果 结直肠癌患者粪便DNA中MAL、CDKN2A、MGMT基因启动子甲基化率分别为78.3%、52.5%、55.1%,腺瘤患者分别为58.3%、41.7%、37.5%,增生性息肉患者分别为26.3%、15.8%、10.5%,正常对照人群分别为3.8%、0、3.8% 结直肠癌和腺瘤患者3个基因甲基化水平均显著高于增生性息肉患者和正常对照人群（均P＜0.05）.3个基因甲基化联合检测诊断结直肠癌和腺瘤敏感度分别为92.8%和70.8%,明显高于FOBT的29.0%和25.0%（均P＜0.05）.3个基因甲基化状态与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、远处转移及TNM分期均无关（均P＞0.05）.结论 粪便中MAL、CDKN2A、MGMT基因启动子甲基化水平在结直肠癌和腺瘤患者中明显升高,其联合检测可望成为结直肠癌及其癌前病变筛查的非侵入性检测方法.     

RASSF1A在胃癌中的表达及其甲基化状态的研究

目的：研究胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化及其蛋白表达情况,分析两者之间的关系及其在胃癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组化SP法检测39例胃癌组织,39例相应癌旁组织及30例对照组织中RASSF1A蛋白表达,应用甲基化特异性PCR法检测上述组织RASSF1A启动子CpG岛甲基化状态。结果：1）胃癌组RASSF1A蛋白表达阳性率53.8%明显低于癌旁组97.4%及正常对照组100%（P〈0.05）;2）胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化率为64.1%,显著高于癌旁组织甲基化率7.7%及对照组0%（P〈0.05）;3）在胃癌组织中,甲基化组RASSF1A蛋白表达明显低于非甲基化组（P〈0.05）。结论：胃癌组织RASSF1A蛋白表达缺失或低下,与其启动子甲基化程度增高显著相关,RASSF1A启动子甲基化在胃癌发生、发展中起一定作用。     

脾酪氨酸激酶基因甲基化与结直肠癌临床病理特征之间的关系

目的探讨脾酪氨酸激酶（Syk）基因甲基化、表达水平与结直肠癌患者临床病理特征及预后之间的关系。方法收集2001年1～12月间经手术治疗的120例结直肠癌标本．采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）分析Syk基因的甲基化状态和表达情况，并分析Syk基因甲基化失表达与结直肠癌临床病理特衙和生存预后之间的关系。结果（1）120例结直肠癌患者中，48例肿瘤组织未检测到Syk基因的表达，而正常组织Syk基凶均表达；差异有统计学意义（X^2=60，P=0．000）。（2）发生甲基化的37例肿瘤组织中，Syk基因均失去表达。未发生甲基化的83例中，仅11例失表达；而癌旁匹配的正常组织均有表达。（3）Syk基因的甲基化状态与结直肠癌的淋巴结转移状态、病理分期密切相关，而与其他临床参数无关。（4）术后随访资料表明，Syk基因甲基化组患者的3年生存率明显低于未甲基化组（73．5％比95．7％，P=0．007）；而术后复发转移率明显高于未甲基化组（32．4％比8．4％，P=0．02）。结论Syk基因过甲基化失表达参与了结直肠癌的发生，导致结直肠癌侵袭性增强，患者术后复发转移率升高，3年生存率降低。     

WIF-1基因启动子区甲基化在胃癌组织中的检测

目的检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中WIF-1基因启动子区甲基化情况,并结合临床病理资料,探讨WIF-1基因甲基化状态与胃癌发生、发展的相关性。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation—specinc PCR,MSP）检测30例胃癌组织、30例癌旁组织及10例正常胃黏膜组织中WIF-1基因启动子区甲基化情况。结果胃癌组织、癌旁组织及正常对照组WIF-1基因启动子甲基化阳性率分别为76．6％（23／30）、13．3％（4／30）和0．0％（0／10）,胃癌组织甲基化率明显高于后两组,差异有统计学意义（均P〈0．05）。胃癌组织中不同年龄、性别、分化程度的WIF-1基因甲基化阳性率差异均无统计学意义;有淋巴结转移组甲基化率（90％）高于无淋巴结转移组甲基化率（50％）,差异有统计学意义（P〈0．05）;而Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期胃癌组织中WIF-1基因甲基化阳性率分别为90．5％与44．4％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论WIF-1基因启动子区发生高甲基化导致其表达下调或缺失与胃癌的发生、发展以及临床病理特征有着密切的关系,通过MSP法检测胃癌组织及正常组织的甲基化率,为胃癌的早期诊断及综合治疗寻找新的靶点。     

结直肠癌侵袭性与脾酪氨酸激酶基因Syk启动子甲基化的关系

目的　探讨脾酪氨酸激酶 (Syk)基因启动子甲基化与结直肠癌侵袭转移之间的关系。方法　采用巢式双重甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP)和逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)的方法检测Syk基因在 12 0例结直肠癌肿瘤组织、癌旁正常组织中的甲基化和表达情况。 结果　 12 0例结直肠癌患者中 ,48例未检测到SykmRNA的表达 ,而癌旁正常组织均有表达。癌旁正常组织未检测到Syk基因启动子甲基化 ,3 7例肿瘤组织发生Syk基因启动子甲基化(3 0 .8% ) ,癌组织Syk基因启动子甲基化率显著增高 (P <0 .0 0 0 5 )。在淋巴结转移的 5 6例中 ,2 4例发生Syk基因启动子甲基化 ,而无淋巴结转移的 64例中 ,13例发生甲基化 ,有淋巴结转移的Syk基因启动子甲基化发生率显著高于无淋巴结转移组 (P =0 .0 0 8)。发生甲基化的肿瘤组织中 ,均无SykmRNA的表达。结论　结直肠癌中 ,SYK基因启动子过甲基化导致其mRNA的失表达 ,从而引起结直肠癌的侵袭性增强 ,它可能是结直肠癌发生侵袭转移的又一种机制。     

散发性结直肠癌中SMAD4基因的突变

目的观察SMAD4基因在散发性结直肠癌中的突变，并探讨其对散发性结直肠癌发生发展的意义。方法对本院83例散发性结直肠癌患者，应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR—SSCP）分析癌组织中SMAD4基因各外显子的突变情况，基因突变率与临床病理参数间采用，检验；应用多态性微卫星标记研究SMAD4基因所在18q21区的杂合性缺失。结果SMAD4基因在83例散发性结肠癌的患者中共有9例发生突变，平均突变率为10．8％。经Χ^2检验SMAD4基因突变率在肿瘤的Dukes分期及有无远处转移间差异有统计学意义（P〈0．05），而与肿瘤的分化程度、发生部位及患者的性别差异无统计学意义（P〉0．05）。18q21区的杂合性缺失率为62．71％，其中发生突变的9例均存在18q21区的杂合性缺失。结论SMAD4基因的突变可能介导了散发性结直肠癌后期的发生发展。     

肝细胞癌中CHFR、EDNRB和3-OST-2基因异常甲基化的研究

目的研究肝细胞癌中细胞有丝分裂前期检查点（checkpointwithforkhead-associatedandringtinge，CHFR）基因、内皮素B受体（endothelinreceptorB，EDNRB）基因和3-0-硫基转移酶-2（heparansulfateD．glucososaminyl3-0-sulfotransferase-2，3-OST-2）基因启动子区异常甲基化状态及其临床意义。方法收集癌组织及相应癌旁组织标本40例，以及14例肝血管瘤患者肝脏和2例肝移植供肝标本，并排除乙肝病毒感染和肝硬化。使用甲基化特异性PCR反应检测上述标本中CHFR、EDNRB和3-OST-2基因的甲基化状态。结果CHFR基因在癌组织和癌旁组织的甲基化率分别为52．5％和27．5％，癌组织中的甲基化率高于癌旁组织（P〈0．05）。EDNRB基因在癌组织和癌旁组织中的甲基化率都为27．5％。3-OST-2基因在癌组织中甲基化率为12．5％，癌旁组织没有发现甲基化。16例正常肝组织中没有发现上述3种基因的异常甲基化。癌组织中CHFR基因甲基化与非甲基化患者相比，男性多于女性。癌旁组织中EDNRB基因甲基化患者肿瘤的包膜出现率低于非甲基化患者。癌组织中3-OST-2基因甲基化患者的年龄和肿瘤直径大于非甲基化患者。结论肝细胞癌中CHFR基因、EDNRB基因启动子的高甲基化是普遍现象，而3-OST-2基因启动子甲基化率较低。     

Survivin和RASSF1A基因在大肠癌中的表达及其临床意义

为研究大肠癌组织中生存素(survivin)基因与Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因表达与大肠癌发生、发展的关系,利用逆转录PCR技术,测定60例大肠癌组织及20例癌旁组织中survivin基因与RASSF1A基因的mRNA表达情况;利用甲基化特异性PCR(MSP)技术对RASSF1A启动子甲基化情况进行了鉴...     

结直肠癌术中腹腔灌洗液悬浮细胞CDH1甲基化检测及其临床意义

目的 检测结直肠癌术中腹腔灌洗液悬浮细胞中CDH1基因甲基化状态并探讨其与结直肠癌临床病理资料及预后的关系.方法 前瞻性纳入2011年10月至2013年10月间中山市中医院手术治疗的原发性结直肠癌患者.采用实时荧光甲基化特异性聚合酶链反应技术,检测术中腹腔灌洗液悬浮细胞中CDH1基因启动子区域5＇-CpG岛的甲基化状态,将甲基化百分率大于20％定义为甲基化,小于或等于20％为非甲基化;分析CDH1基因甲基化状态与结直肠癌临床病理特征及预后的关系.结果 共102例患者纳入研究,其中CDH1甲基化组47例,非甲基化组55例.与非甲基化组比较,甲基化组患者肿瘤直径更大,浸润型比例更高,分化程度更低,淋巴结转移和远处转移率更高,临床分期更晚（均P＜0.05）.甲基化组患者中位生存期短于非甲基化组（26.0月比41.4月,P＜0.05）.Cox模型分析显示,CDH1甲基化状态是结直肠癌患者术后生存的独立危险因素（RR=27.5,95％CI：3.8～51.3,P＜0.01].结论 术中腹腔灌洗液悬浮细胞中CDH1基因发生甲基化的结直肠癌患者恶性程度较高,易发生淋巴结转移和远处转移,预后较差。     

胃癌患者术前腹腔冲洗液中CDH1甲基化状态及其临床意义

目的探讨术前腹腔冲洗液中CDHl基因的异常甲基化与胃癌进展的关系。方法采用实时荧光甲基化特异性聚合酶链反应技术．检测92例胃癌患者术前腹腔冲洗液中CDHl基因启动子区域5’-CpG岛的甲基化状态．并分析其与临床病理因素及预后之间的关系。结果92例胃癌患者中．有45例（48．9％）检测到了CDHl基因异常甲基化现象,其中完全甲基化12例（13．0％）,部分甲基化33例（35．9％）。CDHl基因甲基化与肿瘤大小、生长方式、分化程度、淋巴管侵犯、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期有关（均P〈0．05）,而与性别、年龄、肿瘤部位及幽门螺杆菌感染无关（均P〉0．05）。CDHl甲基化与非甲基化患者术后中位无进展生存期分别为20和38个月,差异有统计学意义（P〈0．01）。经Cox模型分析证实,术前腹腔冲洗液DNA中的CDHl甲基化状态是影响胃癌患者术后生存的独立预后因素（P=0．000,RR=332．88,95％CI：21．71-5105．07）。结论CDHl基因启动子区域5＇-CpG岛的异常甲基化在胃癌中属于高频分子事件．术前腹腔冲洗液DNA中CDHl甲基化分析可反映胃癌进展状况。     

E-钙黏附素基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系

目的探讨E-钙黏附素（E-cadherin）基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系。方法采用甲基化特异性巢式PCR技术（nMSP法）研究100例结直肠癌组织及100例癌旁组织E-eadherin基因甲基化与临床病理特征的关系。结果100例结直肠癌组织中有33例呈E-cad基因甲基化阳性（阳性率33.0％），相应的癌旁组织无甲基化。Dukes分期中C、D期组织E-cad基因甲基化阳性率（72.7％）明显高于A、B期（27.3％）（P〈0.05）；伴肝转移的结直肠癌组织甲基化阳性率（81．8％）明显高于无肝转移者（18．2％）（P〈0．01）；在肿瘤细胞分化程度、大体类型、年龄、性别和肿瘤部位等其他病理特征，E-cad基因甲基化阳性组与阴性组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论结直肠癌组织E-cad基因甲基化与淋巴结转移、肝转移和Dukes分期明显相关，E-cad基因甲基化可能是结直肠癌侵袭性增强的原因之一。     

RASSF1A启动子甲基化与非小细胞肺癌TNM分期关系的Meta分析

目的探讨RASSF1A启动子甲基化与非小细胞肺癌TNM分期的关系。方法在中外数据库中收集研究非小细胞肺癌组织RASSF1A启动子甲基化的文献,制定严格的入选和剔除标准．最后入选的文献用META分析软件Review Manager 5．0对甲基化与TNM分期进行分析,计算合并的OR值。结果共有5篇文献入选,NSCLC中Ⅰ期与Ⅱ-Ⅳ期差异分析显示在95％CI时,合并OR值为1．24（范围在0．90—1．72）,Z=1．30,P=0．47〉0．05,表明RASSF1A启动子甲基化在各期肺癌均可出现,在早期和中晚期肺癌组织中RASSF1A甲基化程度不存在差别（P〉0．05）。结论RASSF1A启动子甲基化是非小细胞肺癌发生发展过程中的一个分子事件,与非小细胞肺癌TNM分期无明显相关性,可以作为非小细胞肺癌的早期分子诊断候选指标。