人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中“干”性蛋白表达的研究

检测原代分离培养的人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中CD29、CD34、CD44、CD133、HLA-DR、vWF、MRP1、ABCG2 、P75NTR及Nestin的表达.采用组织块贴壁培养法分离培养人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞,通过培养扩增后用流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD133、HLA-DR及vWF的表达,应用免疫荧光技术检测人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中MRP1、ABCG2、P75 NTR、Nestin的表达.在培养的人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中,流式细胞仪检测示CD29、CD44表达阳性,CD34、CD133、HLA-DR及vWF表达阴性;免疫荧光示MRP1、ABCG2 、P75NTR及Nestin在人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中表达阳性且荧光定位在细胞的胞浆.人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞表达间充质干细胞的免疫表型;MRP1、ABCG2、P75NTR、Nestin在人脐带、胎盘间充质干细胞样细胞中表达阳性,提示人脐带与胎盘来源的间充质干细胞样细胞“干”性蛋白的表达情况相似.     

人脐带间充质干细胞的富集及向神经细胞的诱导分化

目的:寻找一种稳定、高效的分离人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并探讨脐带MSCs向神经细胞方向分化的可能性。方法:分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离人脐带MSCs,对比其培养成功率;BrdU掺入实验检测脐带MSCs的增殖能力;流式细胞仪检测脐带MSCs表面分子标志;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,免疫荧光方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;BrdU阳性标记率达90%以上;流式细胞仪检测显示细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达CD34;脐带MSCs经诱导分化,伸出长突起,呈神经元样细胞改变,且表达神经元标志性蛋白NSE、MAP2。神经胶质细胞标志性蛋白GFAP表达较少。结论:成功建立了高效、稳定的脐带MSCs分离培养方法。脐带MSCs经诱导可向神经细胞方向分化,为临床移植治疗神经系统疾病提供了理想的细胞来源。     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

人胎盘间充质干细胞体外向胆碱能样神经元的分化

背景:胎盘中含有与骨髓中类似的间充质干细胞,也可能具有多向分化能力。目的:探讨人胎盘间充质干细胞体外能否定向诱导分化为胆碱能样神经元。方法:采用酶消化法分离培养人胎盘间充质干细胞,传至第4代,先用胎牛血清+碱性成纤维细胞生长因子诱导培养2d,然后分为3组:方案Ⅰ加入含碱性成纤维细胞生长因子、2-巯基乙醇、维甲酸、神经生长因子的DMEM/F12继续诱导19d;方案Ⅱ在其基础上,诱导液中另加入表皮生长因子、Heparin;阴性对照组仅加入含胎牛血清的DMEM/F12培养液,不添加任何诱导剂。结果与结论:胎盘组织消化后获得的贴壁细胞,经2周培养后逐渐形成扁平单层细胞,呈平行排列或漩涡样成簇生长,为梭形,传至第3代细胞形态较均一。第4代人胎盘间充质干细胞强表达CD44,CD29,不表达CD34,CD45,CD106及HLA-DR。人胎盘间充质干细胞经方案Ⅰ和方案Ⅱ诱导2周后,均可检测到nestin、chat mRNA的表达,且chat,Ache,nestin阳性率显著高于阴性对照组细胞(P0.05)。与阴性对照组比较,经两种方案诱导的人胎盘间充质干细胞培养上清液中乙酰胆碱浓度均明显升高(P0.05),且方案Ⅰ诱导组升高幅度明显大于方案Ⅱ诱导组(P0.05)。提示联合多种生长因子分阶段进行诱导,人胎盘间充质干细胞可在体外分化为具有合成及释放降解乙酰胆碱能力的胆碱能样神经元细胞。     

卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

本实验观察了卵泡抑素(follistatin)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。利用Percoll密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养和扩增成人的BMSCs,通过流式细胞术分析鉴定BMSCs的纯度,用follistatin诱导第三代生长良好的MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果显示:流式分析获得了纯度较高的BMSCs,细胞表达CD29、CD44、CD106和CD166,不表达CD34和CD45。诱导10d后,细胞呈现双极、多极和锥体形的典型神经元细胞形态,并且在mRNA水平证明诱导分化后的细胞与对照组比较NSE和Nestin的表达增加(P<0.05)。上述结果表明follistatin可以在体外诱导人的BMSCs分化为神经样细胞。     

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法:采用Ficoll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达,FGF-2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(nestin)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10⁶,15代可获得(2-3)×10¹²个细胞,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。FGF-2促进hMSC生长,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论:丹参酮ⅡA可以在体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后免疫原性研究

目的:通过体外天麻诱导人骨髓间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)向神经元样细胞分化,验证其多能分化特性,检测分化后细胞的免疫原性.方法:通过贴壁法分离hMSCs,体外扩增培养.天麻定向诱导分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.流式细胞术(FCM)检测分化后细胞HLA-DR表达,用单向混合淋巴细胞反应(MLR)的方法检测神经细胞分化的hMSCs是否引起人外周血淋巴细胞增殖反应(Human peripheral blood lymphocytes,hPBLs).结果:hMSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.天麻诱导3小时后大部分hMSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性.流式细胞术显示hMSCs向神经细胞分化后HLA-DR表达阴性,混合培养结果也显示分化hMSCs不引起hPBLs增殖反应.结论:天麻可在体外诱导hMSCs分化为神经元样细胞,分化hMSCs不引起人淋巴细胞增殖反应,具有低免疫原性.     

诱导人卵黄囊间质干细胞向成骨细胞及神经细胞定向分化

目的：分离纯化及体外定向诱导人卵黄囊间质干细胞 (hYS-MSC)分化为成骨细胞及神经细胞。方法： 卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到hYS-MSC，检测其表面抗原表达、对其进行核型分析、细胞周期检测并测定AKP活性；采用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C作成骨诱导剂、β-巯基乙醇或复方丹参注射液作为神经诱导剂诱导hYS-MSC向成骨细胞及神经细胞定向分化。组织化学方法作成骨检测；免疫组化方法检测NSE、NF及GFAP在经神经诱导hYS-MSC中的表达。结果： hYS-MSC易于纯化，在培养过程中保持正常核型，具有较大增殖能力。hYS-MSC CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性, CD34、CD45和CD86为阴性；AKP弱阳性。hYS-MSC经成骨诱导AKP强阳性，诱导两周后形成钙盐沉积形成的矿化区。hYS-MSC经神经诱导可见NSE、NF或GFAP阳性细胞，符合神经元及胶质细胞的生物学特征。结论： hYS-MSC在体外培养过程中具有较大增殖能力并保持正常核型，与成体MSC表型一致，在体外可以诱导分化为成骨细胞、神经元及胶质细胞。     

维甲酸诱导小鼠胚胎干细胞向神经样干细胞分化

目的探讨维甲酸（RA）诱导体外培养的小鼠胚胎干细胞（ESC）向神经样干细胞定向分化。方法在无白血病抑制因子（LIF）存在的条件下，将体外培养的ESC悬浮培养4天，形成拟胚体（EB），再经RA诱导4天后进行细胞冰冻切片，行免疫细胞化学染色计数生殖特异性基因Oct-4和神经干细胞特异性标志物Nestin的表达百分率。结果经诱导的ESC呈现Oct-4阳性细胞百分率为67．34％，而Nestin阳性细胞百分率为36．52％。结论体外培养的小鼠ESC经RA诱导后有部分细胞定向诱导分化为神经样干细胞。     

体外诱导恒河猴骨髓基质细胞分化为神经细胞的分化条件

目的比较血清维甲酸(retinoic acid,RA)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)等在不同浓度诱导条件下使恒河猴骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)诱导分化为神经干细胞(NSCs)及成熟神经细胞的分化条件。方法用Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色,鉴定NSCs;用NSE、β-tublin鉴定神经元;用GFAP鉴定神经胶质细胞,膜片钳检测分化成熟细胞的电生理特性。结果培养第8天多数细胞表现出Nestin及CD133抗原阳性,即为NSCs细胞;诱导后3天即有神经元样细胞出现,此后神经元样细胞逐渐增多,膜片钳检测发现这些细胞具有类似神经细胞的电生理特性。同时,与其他培养条件相比较,低浓度血清(2．5％) RA GDNF组诱导分化效能最高。结论应用RA GDNF及配合使用低浓度血清能够高效诱导骨髓源NSCs向成熟神经细胞分化。     

体外诱导胎盘间充质干细胞向表皮细胞的分化

背景：以往研究证明胎盘间充质干细胞经诱导可以向骨、软骨、肌肉、脂肪等间充质细胞分化。 目的：探讨体外诱导胎盘间充质干细胞分化为表皮细胞的可行性。 方法：分离培养胎盘间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其表面抗原,用含体积分数为2%胎牛血清以及20 μg/L表皮生长因子条件培养基诱导,诱导后细胞通过表皮细胞标志物CK19以及CK10染色鉴定。 结果与结论：胎盘间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,表皮细胞标志物CK19以及CK10免疫荧光染色阳性,提示胎盘间充质干细胞在体外具有分化为表皮细胞的能力,可以作为皮肤组织工程和干细胞研究的一种有效来源。     

嗅黏膜神经干细胞的体外培养和向酪氨酸羟化酶阳性神经元的分化

目的:建立体外培养和诱导嗅黏膜神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的方法,探讨该细胞的干性和分化特性。方法:首先用含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养成年大鼠嗅黏膜细胞,当细胞贴壁后将培养基更换为含表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF),不含血清的干细胞培养基,以促进干细胞增殖形成神经球。将神经球取出用干细胞培养基悬浮培养以纯化扩增神经干细胞。应用干细胞相关蛋白Nestin及CD133的抗体对神经干细胞进行免疫荧光染色,观察上述蛋白在细胞的表达。用Neurobasal培养基(含B27、NGF、ATRA及SHH)培养扩增后的神经干细胞,诱导其向神经元分化。用神经丝蛋白(neurofilament-200,NF-200)和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体对分化的细胞进行免疫荧光染色;用免疫印迹法检测上述细胞裂解样品内的相应标志蛋白的电泳条带。结果:嗅黏膜神经干细胞高表达Nestin及CD133两种神经干细胞标志蛋白;干细胞经诱导分化后其形态具有神经元特征,并且高表达NF和TH两种神经细胞标志蛋白。结论:贴壁/悬浮序贯培养方法可体外纯化扩增嗅黏膜神经干细胞,该细胞可分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。方法分离培养骨髓间充质干细胞，鉴定其表面抗原，用含2％胎牛血清以及50ng／ml血管内皮生长因子的条件培养基诱导，诱导后细胞通过内皮细胞标志物KDR、FLT-1以及v-WF染色鉴定。结果骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性，CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变，内皮细胞标志物KDR、FLT-1以及v-wF染色结果阳性。结论骨髓间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力，可以作为干细胞治疗的一种有效来源。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

The epigenetic regulation of stem cell factors in hepatic stellate cells

The epigenetic regulation by DNA methylation is an important mechanism to control the expression of stem cell factors as demonstrated in tumor cells. It was recently shown that hepatic stellate cells (HSC) express stem/progenitor cell factors and have a differentiation potential. The aim of this work was to investigate if the expression of stem cell markers is regulated by DNA methylation during activation of rat HSC. It was found that CD133, Notch1, and Notch3 are regulated via DNA methylation in HSC, whereas Nestin shows no DNA methylation in HSC and other undifferentiated cells such as embryonic stem cells and umbilical cord blood stem cells from rats. In contrast to this, DNA methylation controls Nestin expression in differentiated cells like hepatocytes and the hepatoma cell line H4IIE. Demethylation by 5-Aza-2-deoxycytidine was sufficient to induce Nestin in H4IIE cells. In quiescent stellate cells and embryonic stem cells, the Nestin expression was suppressed by histone H3 methylation at lysine 9, which is another epigenetic mechanism. Apart from the known induction of Nestin in cultured HSC, this intermediate filament protein was also induced after partial hepatectomy, indicating activation of HSC during liver regeneration. Taken together, this study demonstrates for the first time that the expression of stem cell-associated factors such as CD133, Notch1, and Notch3 is controlled by DNA methylation in HSC. The regulation of Nestin by DNA methylation seems to be restricted to differentiated cells, whereas undifferentiated cells use different epigenetic mechanisms such as histone H3 methylation to control Nestin expression.     

脐血来源的CD29~+细胞神经转分化的研究

目的:脐血中分离CD29+细胞并诱导其转化为神经元样细胞,为神经损伤与修复提供种子细胞来源。方法:免疫磁珠法分离出脐血CD29+细胞,体外培养扩增。取2代细胞以BDNF、GDNF、PDGF为诱导因子对其进行神经诱导分化。观察细胞形态、生长情况,流式细胞仪检测细胞周期、表型及HLA相关抗原。诱导后免疫组织化学染色法检测Nestin、NSE、NF、GFAP表达。Western Blot检测β-tubulin、Tau的表达。结果:细胞贴壁生长,呈长梭形,细胞表型为CD29+、CD44+、CD166+。在诱导后,细胞逐渐增大并伸出明显突起。免疫组织化学染色结果显示,Nestin、NSE、NF、GFAP表达阳性。Western Blot显示了相应蛋白的表达。结论:脐血CD29+细胞在体外可以向神经元样细胞转化,有望成为异体修复神经损伤的种子细胞来源。     

细胞传代对骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的影响

BACKGROUND:It is unclear whether serial cell passage in vitro influences the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural stem cells. OBJECTIVE:To investigate the effect of cell passage on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural stem cells. METHODS:Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured by the whole bone marrow adherence method. Bone marrow mesenchymal stem cells at passages 3, 6, 9, 12 were incubated in serum-free medium. After culture for 7 and 14 days, cell biological characterization was observed and differenitaiton ability into neural stem cells was observed by detecting Nestin expression in cells using flow cytometry. Then, the cells were further induced to differentiate and cell multipotential differentiation capacity was detected by measurement of nerve enolase and glial acidic protein expression. RESULTS AND CONCLUSION:Under induction, bone marrow mesenchymal stem cells at different passages were all differentiated into Nestin-positive neural stem cells. However, there was a significant difference in differentiation proportion of cells at different passages (P < 0.05). Strongest differentiation ability was found in the passage 6 cells, with the Nestin expression up to (93.7±2.3)% at 7 days of induction and (96.2±1.8)% at 14 days of induction. The proportion of differentiated cells at passages 6 and 9 was signfiicantly higher than that at passages 3 and 12. Moreover, adherent cells were positive for nerve enolase and glial acidic protein. All these findings indicate that the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural stem cells is correlated with cell passage. Cells at lower or higher passages are both detrimental to cell differentiation.     

人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定

目的分离提纯的人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定。方法剥去38～40周孕妇剖腹产术后羊膜,用消化酶消化后制备人羊膜间充质细胞（hAMCs）悬浮液。利用流式细胞分选技术从hAMCs中分离提纯干细胞（hAMC-SP细胞）,并对于细胞抗原进行鉴定。结果从hAMCs中分离的hAMC-SP细胞,约占AMCs总数的0．3％。传代培养4～10代后的hAMC-SP细胞表达Nestin、Vimentin、整合素家属成员（CD49b、CD49c、CD49d、CD49e）、CD9、CD13、CD19、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CD166及干细胞相关的Oct-3／4抗原。HLA-ABC、TRA-1-81及SSEA-4为弱表达;相反CD34、CD45、CD117、CD56、CD90、CD105、CD106、CD133、Fit-1、Musashi 1及HLA-DR无阳性结果,同样TRA-1-60及SSEA-3也表达阴性。体外转化实验表示hAMC-SP细胞在琼脂糖培养基上不形成细胞集落,但阳性对照组的HepG2形成多数细胞集落。结论hAMC-SP细胞表面标记符合骨髓及脂肪间充质等来源的干细胞特点;hAMC-SP细胞迅速而稳定扩增,无致瘤性。由于来源充足,hAMC-SP细胞在消除HLA-ABC阳性细胞亚群下,同种异体移植在内的广泛的再生医学领域中能成为理想的细胞来源。     

Systematic analysis of reportedly distinct populations of multipotent bone marrow-derived stem cells reveals a lack of distinction

Adult human bone marrow-derived stem cells, having the ability to differentiate into cells of multiple lineages, have been isolated and propagated by varied protocols, including positive (CD105(+))/negative (CD45(-)GlyA(-)) selection with immunomagnetic beads, or direct plating into selective culture media. Each substratum-adherent cell population was subjected to a systematic analysis of their cell surface markers and differentiation potential. In the initial stages of culture, each cell population proliferated slowly, reaching confluence in 10-14 days. Adherent cells proliferated at similar rates whether cultured in serum-free medium supplemented with basic fibroblast growth factor, medium containing 2% fetal bovine serum (FBS) supplemented with epidermal growth factor and platelet-derived growth factor, or medium containing 10% FBS alone. Cell surface marker analysis revealed that more than 95% of the cells were positive for CD105/endoglin, a putative mesenchymal stem cell marker, and negative for CD34, CD31, and CD133, markers of hematopoietic, endothelial, and neural stem cells, respectively, regardless of cell isolation and propagation method. CD44 expression was variable, apparently dependent on serum concentration. Functional similarity of the stem cell populations was also observed, with each different cell population expressing the cell type-specific markers beta-tubulin, type II collagen, and desmin, and demonstrating endothelial tube formation when cultured under conditions favoring neural, cartilage, muscle, and endothelial cell differentiation, respectively. On the basis of these data, adult human bone marrow-derived stem cells cultured in adherent monolayer are virtually indistinguishable, both physically and functionally, regardless of the method of isolation or proliferative expansion.     

人胚胎脑室脉络丛上皮细胞表达神经干细胞分子标志

目的 探讨人12周龄胚胎脑脉络丛上皮细胞是否具有神经干细胞的生物学特性.方法制备室管膜/室管膜下区和纹状体脑切片和脉络丛组织铺片,采用免疫荧光染色,在激光扫描共焦显微镜下观察结果,采集图像数据.结果人12周龄胚胎脑室脉络丛上皮细胞表达神经干细胞分子标志CD133、Nestin和Sox2.神经干细胞的分子标志在脉络丛上皮...