碱性成纤维细胞生长因子诱导牛晶状体上皮细胞增殖细胞核抗原的表达及对晶状体上皮细胞增殖作用的研究

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导牛晶状体上皮细胞（bovine lens epithelial cell,BLEC)增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及对BLEC增殖的作用。方法 取体外培养的第2代BLEC,加入不同浓度的bFGF(0.01-100.00μg/L）共同培养24－96h后,用^3H-TdR掺入法测定BLEC DNA合成率,用流式细胞仪检测细胞周期和PCNA的表达。结果 不同浓度的bFGF有促进BLEC增殖作用,并呈剂量时间依赖性,当浓度为10.00μg/L的bFGF作用BLEC24－48h后,晶状体上皮细胞的^3H-TdR掺入值分别为11772．5和10988．2,较对照组的6550．5增加约一倍,两组比较差异有显著意义（P＜0．05）。bFGF作用BLEC可使PCNA表达率上升（77．40％）,并使BLEC周期发生变化,S期细胞和G2／M期细胞比例分别提高至23．41％和20．76％,与对照组比较,差异有显著意义（P＜0．05）。结论 bFGF通过上调BLEC的PCNA表达,改变细胞周期,致使BLEC进入增殖状态。     

碱性成纤维细胞生长因子对人晶状体上皮细胞增殖及移行作用的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对体外培养的人晶状体上皮细胞（HLEC）增殖及移行作用的影响.方法 在无血清培养液培养的HLEC中分别加入不同终浓度的bFCF（0.01、0.1、1、10及100 μg/L）,MTT法测定其促细胞增殖的情况;流式细胞仪分析细胞周期;HLEC损伤愈合模型,观察不同终浓度bFGF处理24 h后HLEC的移行情况.结果 bFGF浓度为0.1、1、10、100 μg/L时,其对HLEC细胞有明显的促增殖作用,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）,100 μg/L作用24 h增殖率最大,达112.78%,作用强度呈浓度时间依赖性.bFGF通过促进细胞周期变化,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）,G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多,通过促进HLEC由G0向G1的转化来促进细胞的增殖;bFGF浓度1、10、100 μg/L作用24 h.可明显促进HLEC的移行,其移行能力分别为27.21%、154.42%、和238.77%,与阴性对照组相比,差异有显著统计学意义（P〈0.01）.结论 bFGF可促进HLEC的增殖和移行,是HLEC强有力的有丝分裂原和促移行因子.     

RNA干扰抑制端粒酶反转录酶对晶状体上皮细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰(RNAi)抑制端粒酶反转录酶(TERT)对晶状体上皮细胞(LEC)增殖的影响。方法收集培养的LEC和视网膜色素上皮细胞(RPEC),用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测二者内源性TERT的表达差异;人工合成TERT小分子干扰RNA(siRNA)片段,用LipofectamineTM2000转染LEC,实时PCR检测TERT基因表达的变化。LipofectamineTM2000TERTsiRNAi持续转染LEC和RPEC96h,细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测TERTsiRNAi对LEC和RPEC增殖的影响。结果 RPEC中未见TERT表达,LEC中有低水平TERT表达。TERTsiRNA转染LEC48h后,siRNA组TERT相对表达水平(0.20±0.01)与阴性对照组(1.00±0.03)相比,差异有统计学意义(P<0.05)。TERTsiRNA转染LEC和RPEC96h后,CCK-8试剂盒检测细胞的增殖抑制情况显示:LECsiRNA组LEC活性(0.55±0.04)与LEC阴性对照组(0.79±0.02)相比,差异有统计学意义(P<0.05);转染的RPECsiRNA组RPEC活性(1.13±0.04)与阴性对照组RPEC活性(1.16±0.01)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论较长时间RNAiTERT能有效抑制LEC增殖,但对RPEC无明显抑制作用。     

短发夹状RNA干扰bcl-2后诱导人晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 应用RNA干扰技术抑制人品状体上皮细胞(HLEC)bcl-2基因表达,观察诱导其细胞凋亡情况,为防治晶状体后囊膜混浊提供新的策略.方法 实验研究.设计2条以bcl-2基因为靶标的短发夹RNA(shRNA),克隆入质粒PGCsi表达载体,分别命名为P1、P2,经脂质体转染入永生性HLEC系SRA01/04,48 h后检测转染效率和bd-2的基因及蛋白表达情况,并检测HLEC的细胞凋亡情况.多组间及组间计数资料的比较,采用随机区组设计的方差分析.结果 重组质粒经自动基因测序仪测序,证实构建成功.转染后48 h,流式细胞仪测得P1、P2转染率为44.1%、47.2%.免疫印迹法测得P1、P2组的bcl-2蛋白表达较对照组降低,实时荧光定量聚合酶链反应法测得P1、P2组的bcl-2 mRNA相对表达量为0.435、0.476,较对照组降低(F=1672.4,P<0.05),流式细胞仪双染法测得P1、P2组HLEC的细胞凋亡率分别为42.3%、45.4%,较对照组增加(F=1756.2,P<0.05),并且活化型caspase-3蛋白的表达增加.结论 P1、P2可抑制HLEC的bcl-2基因表达,并诱导HLEC凋亡.(中华眼科杂志,2009,45:636-640)     

碱性成纤维细胞生长因子对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ,bFGF)对兔晶状体上皮细胞（rabbit lens epithelia cell,RlECs)的作用。方法：采用bFGF作用于第2－3代培养细胞,用MTT法测定细胞对增殖的影响;电观察细胞形态的变化,流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果：bFGF可促进晶状体上皮细胞的增殖,尤其是浓度为10μg.L^-1作用最明显,透射电镜显示细胞增殖活跃,流式细胞仪观察进入S期的细胞明显增加。结论：bFGF是促进培养兔晶状体上皮细胞增殖的重要因素。     

RNA干扰MMP-2基因对人晶状体上皮细胞增殖及移行能力的影响

目的　研究ＲＮＡ干扰基质金属蛋白酶-２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-２,ＭＭＰ-２）表达对体外培养的人晶状体上皮细胞（ｈｕｍａｎｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ｈＬＥＣｓ）增殖、移行的影响。探讨ＲＮＡ干扰技术抑制ＬＥＣｓ增殖、移行的可行性,以探索防治后发性白内障的新方法。方法　设计构建含有靶向ＭＭＰ-２的短发夹ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ,ｓｈＲＮＡ）质粒载体和不含靶向ＭＭＰ-２的ｓｈＲＮＡ阴性对照质粒载体,体外转染ｈＬＥＣｓＳＲＡ０１／０４,分别标记为ＭＭＰ-２沉默组和阴性对照组;以等体积培养液代替转染质粒培养作为空白对照组。实时荧光定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测转染后２４ｈＭＭＰ-２ｍＲＮＡ及ＭＭＰ-２蛋白的表达水平。ＭＴＴ比色法测定细胞转染后２４ｈ、４８ｈ以及７２ｈ时ｈＬＥＣｓ的增殖能力。细胞划痕实验方法测定转染后２４ｈ、４８ｈ时ｈＬＥＣｓ的移行愈合率。结果　转染２４ｈ后ＭＭＰ-２沉默组ｍＲＮＡ及其蛋白的相对表达水平分别为０．２０２±０．０７５、８０．８５６±２．１６５,与空白对照组１．０４１±０．１６３和１８４．４１９±３．５８４比较分别下降了８０．６％和５５．１％,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）,而阴性对照组与空白对照组相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）;ＭＴＴ比色法检测结果显示,各时间点的细胞增殖能力ＭＭＰ-２沉默组与阴性对照组比较,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）,而２组较空白对照组均有所下降,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;细胞划痕实验示转染２４ｈ与４８ｈ后ＭＭＰ-２沉默组的移行愈合率分别为（２０．３６±４．１４）％和（２３．１９±５．６２）％,较空白对照组（４１．２６±４．５７）％和（６７．６１±８．８０）％以及阴性对照组的（３６．２８±２．２８）％和（７４．４８±９．２１）％均明显降低,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）,阴性对照组与空白对照组相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　靶向ＭＭＰ-２ｓｈＲＮＡ可以有效降低ｈＬＥＣｓＳＲＡ０１／０４ＭＭＰ-２ｍＲＮＡ和蛋白表达,抑制细胞的移行,但尚不能认为对细胞增殖能力有影响。ＲＮＡ干扰ＭＭＰ-２的表达可有效抑制ｈＬＥＣｓ的移行。     

榄香烯抑制人晶状体上皮细胞增殖的蛋白质组研究

目的 探讨中药单体榄香烯对碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)诱导的人晶状体上皮细胞(HLE-B3)增殖的抑制作用及其蛋白质组学规律.方法 实验研究.共分为3组:正常组、rhbFGF组及榄香烯组.正常组为培养的HLE-B3,rhbFGF组加入终浓度为10 μg/L rhbFGF,榄香烯组加入终浓度为10μg/L rhbFGF和80 mg/L榄香烯.24 h后四甲基偶氮唑蓝法检测榄香烯对HLE-B3增殖的抑制作用;蛋白质芯片联合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术检测分析榄香烯作用于HLE-B3后蛋白质表达谱的改变、寻求差异蛋白.采用单因素方差分析,并通过Dunnett-t检验进行正常组、rhbFGF组、榄香烯组吸光度值的两两比较;对每个质荷比峰值做Kruskal-Wallis秩和检验,采用Nemenyi检验对正常组、rhbFGF组、榄香烯组中每个特定质荷比的蛋白质峰值进行两两比较.结果 (1)四甲基偶氮唑蓝法检测显示:rhbFGF组HLE-B3吸光度A值(0.599±0.053)比正常组(0.409±0.042)显著升高,榄香烯组HLE-B3吸光度A值(0.450±0.061)比rhbFGF组显著降低,抑制率达24.90%,差异有统计学意义(F=28.886,P=0.000).(2)用rhbFGF诱导HLE-B3增殖后,出现了5个差异表达的蛋白点,其中质荷比为8093和9516的2个蛋白点表达上调,质荷比为5361、9666及13 767的3个蛋白点表达下调;榄香烯作用于增殖的HLE-B3后,出现10个差异表达的蛋白点,其中质荷比为2487、4392、8566及11 600的4个蛋白点表达上调,质荷比为3679、4826、6861、9516、9557和9672的6个蛋白点表达下调.结论 榄香烯能有效抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增殖,质荷比为9516的蛋白点可能是榄香烯抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增殖的作用靶点.     

碱性成纤维细胞生长因子作用于人晶状体上皮细胞系内Ca2+转导通路的初步研究

目的 初步探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用于人晶状体上皮细胞(LEC)系-B3(LEC-B3)内Ca^2 转导的途径。方法 人LEC-B3传代培养,在激光扫描共焦显微镜下于解冻后的第三代细胞中分别加入10μg／L bFGF、10mmol／L咖啡因、10mmol／L兰尼碱、50mmol／L普鲁卡因及0．5mmol／L金雀异黄素,通过观测细胞内相对荧光强度实时观察细胞内Ca^2 浓度的变化。结果 10μg/L bFGF在细胞外液含或无Ca^2 、Mg^2 的情况下,均可迅速引起人LEC-B3内Ca^2 浓度升高,且持续时间基本相同;而在细胞外液无Ca^2 和Mg^2 、含1mmol／L乙二醇双乙醚四乙酸时,人LEC-B3内Ca2^ 浓度更高。50mmol／L普鲁卡因和10mmol／L兰尼碱与10μg/L bFGF共同作用,人LEC-B3内Ca^2 浓度虽升高,但低于10μg/L bFGF单独作用的效果;10mmol／L咖啡因和0．5mmol／L金雀异黄素可明显降低追加的10μg/L bFGF升高人LEC-B3内Ca^2 浓度的作用,后者尤为明显。结论 bFGF主要通过激活络氨酸蛋白激酶信号转导途径引起人LEC-B3内Ca^2 浓度升高;肌醇1,4,5-三磷酸受体和兰尼碱受体通道发挥一定作用;Ca^2 主要来源于细胞内Ca^2 库释放。（中华眼科杂志,2004,40：832-835)     

RNA干扰技术抑制体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的初步研究

目的 探讨RNA干扰技术对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的抑制作用。方法 采用化学合成的靶向IKK-β的siRNA,转染体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞,同时以对任何基因均无作用的siRNA作为阴性对照。以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测IKK-βmRNA表达水平,免疫印迹法检测IKK-β蛋白表达水平。将siRNA的转染浓度分别设为5、10、25、50、100、200nmol／L,进行转染,于转染后48h采用四甲基偶氮唑盐法检测其转染后对成纤维细胞的抑制作用。结果 经转染了靶向IKK-β的siRNA,其成纤维细胞IKK-β的mRNA和蛋白表达水平均受到抑制。各个转染浓度（5、10、25、50、100、200nmol／L）均可抑制成纤维细胞的增殖（P〈0．05）,抑制率分别为10．72％、23．35％、30．84％、51．25％、50．06％、49．63％,50nmol／L时已达最大抑制率。结论 靶向IKK-β的siRNA转染可以降低IKK-β的表达水平,同时对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞的增殖具有抑制作用。抗IKK-β的RNA干扰技术可能是抑制抗青光眼术后滤过道瘢痕化的新手段。     

bFGF对人晶状体上皮细胞中FAK表达的影响

目的:观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)引起体外培养的人晶状体上皮细胞迁移和黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)mRNA水平的动态变化.方法:体外培养的第3代人晶状体上皮细胞,建立细胞划痕损伤模型,经0,5,10,15μg/L bFGF作用8～16h后,电脑图像法测定细胞迁移距离,RT-PCR法检测0,1,4,8,16h FAK mRNA水平,免疫荧光法检测整合素β1和增殖细胞核抗原表达阳性率的变化.结果:与对照组比,5μg/L 组细胞迁移距离和FAK mRNA表达显著增加(P＜0.05):10μg/L 组细胞整合素β1表达阳性率显著增加(P＜0.05);15μg/L 细胞迁移距离和FAKmRNA显著降低(P＜0.05).结论:bFGF引起人晶状体上皮细胞迁移距离和FAK mRNA表达的变化.     

人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和mRNA的表达

目的 为研究后发性白内障的发生机理,检测生长中人晶体上皮细胞（ＨＬＥＣｓ）自身是否表达碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）。方法 体外培养人晶体上皮细胞,用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交的方法,检测ＨＬＥＣｓ中ｂＦＧＦ多肽和其ｍＲＮＡ的表达。结果 用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交方法,可检测到生长中的人晶体上皮细胞自身表达碱性成纤维细胞生长因子。结论 结合碱性成纤维细胞生长因子促进人晶体上皮细胞生长     

CTGF siRNA转染对体外培养人晶状体上皮细胞株B3转分化的抑制作用

目的:研究脂质体介导CTGF siRNA 转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)株B3 CTGF和α-SMA表达的影响.方法:5`-异硫氰酸荧光素标记的CTGF siRNA与脂质体混合,并转染HLECs,通过荧光转染评估转染率.我们用CCK-8来评价转染组和对照组的细胞活力并使用实时定量RT-PCR,细胞免疫化学和Western blot来分析CTGF和α-SMA在转染后的表达改变.结果:脂质体介导的CTGF siRNA转染呈现出高效的转染率.转染率在24h高达95%.CTGF siRNA 72h转染能有效抑制HLECs的增殖.CTGF siRNA转染24h后CTGF和α-SMA的表达量都显著下降,而对照组则无类似效应.结论:CTGF siRNA 能够有效降低CTGF和α-SMA的表达.     

表皮生长因子对兔角膜上皮细胞增殖及细胞周期相关蛋白作用的研究

目的 探讨表皮生长因子(EGF)对兔角膜上皮细胞的增殖刺激作用及其与细胞周期相关蛋白表达的关系.方法 实验研究.原代培养的兔角膜上皮细胞,以不同浓度(0、15、10、25、50 ug/L)EGF作用72 h、以10ug/L EGF作用不同时间(0、2、4、6、8、10 d)后,通过相差显微镜观察细胞形态,并通过水溶性四氮唑(WST-1)细胞增殖实验检测细胞增殖情况;采用Western blot检测10ug/L EGF作用0、24、48、72 h后细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CDKIs)p21、p27及p18的表达状况.采用SPSS 11.5统计软件对各实验组结果 数据进行统计分析,两样本比较采用t检验,多个样本比较采用单因素方差分析.结果 比较不同浓度的EGF对兔角膜上皮细胞的增殖影响效果,加入5、10、25及50ug/L EGF组72 h的细胞增殖率分别为9.0%、23.5%、20.8%及17.7%,与未加入EGF(0 ug/L)的对照组增殖率相比较,差异有统计学意义(F=45.48,P<0.01),其中10 ug/L EGF对兔角膜上皮细胞的增殖促进作用最强,且相同浓度EGF组兔角膜上皮细胞的增殖率具有明显的时间依赖性.10 ug/L EGF作用0、24、48及72 h,各细胞周期相关蛋白表达量与B肌动蛋白表达量的比值:细胞周期蛋白D1为0.253、0.591、0.885、1.043,CDK4为0.422、0.588、0.804、1.241,表达水平随时间推移逐渐升高,而p27为0.225、0.163、0.107、0.082,表达水平随时间推移逐渐下降,p21为0.432、0.391、0.407、0.329,p18为0.268、0.274、0.231、0.309,表达不随时间推移而变化.结论 EGF对兔角膜上皮细胞具有明显的促增殖作用,可能与其上调细胞周期蛋白D1和CDK4以及抑制p27的表达密切相关.(中华眼科杂志,2009,45:153-157)     

小干扰RNA技术下调视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中Survivin基因表达的研究

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术沉默视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中凋亡抑制因子Survivin的表达,观察其干扰效果及对细胞的影响.方法 实验研究.体外化学法合成针对人Survivin基因的特异性小干扰RNA(siRNA)和对Survivin基因无沉默效果的阴性对照siRNA,利用转染试剂分别将siRNA转入SO-Rb50细胞株,通过半定量RT-PCR和Western blot检测其对SO-Rb50细胞中Survivin基因和蛋白表达的抑制作用,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度siRNA对细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率和细胞周期改变,荧光显微镜下观察细胞凋亡形态.对多组间数据比较采用单因素方差分析,处理组与对照组比较采用Dunnett-t检验.结果 Survivin特异性siRNA转染细胞24 h后Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下调,对照组中其表达则无明显改变.MTT法结果显示Survivin特异性siRNA浓度为35、70、100 nmol/L时均对SO-Rb50细胞增殖具有抑制作用(P＜0.05),且具有剂茸依赖性.流式细胞仪检测发现Survivin特异性siRNA组出现凋亡亚二倍体峰,细胞被阻滞于G0/G1期,较对照组增加了8.11%,G2/M期细胞比例减少了5.75%,S期细胞仅减少了2.26%.荧光显微镜下可见部分细胞出现染色质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡形态学变化.结论 针对Survivin的RNA干扰技术可有效地下调SO-Rb50细胞中Survivin基因表达,进而抑制SO-Rb50细胞增殖和诱导其凋亡,为视网膜母细胞瘤的基因治疗提供了重要的途径.     

白喉毒素氨基端389个氨基酸-人碱性成纤维细胞生长因子靶向毒素的克隆表达及对人晶状体上皮细胞毒性研究

目的 为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法 提取灭活的白喉杆菌DNA和12周胎脑皮质RNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端389个氨基酸(DT389)的基因片段及编码18kd人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化鉴定表达产物,噻唑蓝(MTT)试验检测其对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)的毒性作用,流式细胞术鉴定不同剂量融合毒素所致HLECs成活率及细胞死亡形式.结果 扩增得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达;表达的融合蛋白对HLECs有明显的毒性作用并在一定范围内呈明显剂量依赖性,半数致死量为3.8×10-11mol/L,所致细胞死亡方式主要以凋亡为主.结论 DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物促晶状体上皮细胞的凋亡、抑制后发障的研究奠定了物质基础.     

小干扰RNA保护大鼠视网膜神经节细胞的实验研究

 目的 通过大鼠视神经夹伤模型,研究小干扰RNA（siRNA）对视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用。设计 实验研究。 研究对象 SPF级SD大鼠54只。方法 54只SD大鼠随机分为A、B、C三组,每组18只。均选取右眼为实验眼,左眼为正常对照。在球后2 mm处用40 g压力微型视神经夹夹持视神经60 s,做视神经夹伤模型。建立模型后当天,A、B、C三组分别给予玻璃体注射10 μg、20 μg siRNA和生理盐水。视神经夹伤后10天,每组取6只大鼠用荧光金做逆行标记,14天时取标记后的大鼠双眼眼球标本做视网膜铺片并拍摄照片,RGC计数。计算RGC存活率（右眼RGC数/左眼RGC数×100%）。每组其余12只大鼠进一步用蛋白印迹法检测视网膜组织中caspase-3蛋白的表达水平。主要指标 RGC存活率,caspase-3蛋白的表达水平。结果 A、B、C组RGC存活率分别为53.63%±7.35%、57.86%±6.00%、45.00%±4.37%（F=7.11,P=0.029）,其中A组与C组（P=0.025）,B组和C组（P=0.002）之间均有显著性差异;A 组和B组之间无显著性差异（P=0.24）。A、B、C三组视网膜组织中Caspase-3蛋白与内参灰度比值分别为0.20±0.02、0.19±0.02、0.24±0.03（F=9.73,P=0.02）。其中A组与C组（P=0.005）,B组和C组（P=0.001）之间均有显著性差异;A 组和B组之间无显著性差异（P=0.418）。结论 小干扰RNA能有效保护大鼠视神经夹伤模型的RGC,提高RGC的存活率。     

siNgR重组质粒载体构建及效应检测

目的 构建具有特异阻断大鼠NgR基因功能的siRNA表达系统,为视神经损伤基因治疗提供新的方法 .方法 实验研究.根据Genbank提供的NgR基因mRNA序列,应用设计软件设计特异性的短链寡核苷酸,化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,退火、克隆到经BglⅡ、Hind Ⅲ酶切处理的pSUPER-EGFP质粒,获得重组siNgR质粒,用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切和序列测定对重组体进行鉴定,最后将构建的表达载体转染Wistar大鼠体内视网膜神经节细胞,免疫印迹法观察对NgR蛋白表达的影响.结果 重组siNgR表达载体的酶切鉴定结果 和测序结果 表明重组载体构建成功.视网膜冰冻切片后,经荧光显微镜观察,视网膜神经节细胞层和视神经纤维可见绿色荧光蛋白表达.免疫印迹法分析表明,siNgR-1和siNgR-2可抑制RGCs NgR蛋白的表达,而siNgR-c和pSUPER-EGFP对照对NgR蛋白的表达无明显影响.结论 成功构建了siRNA表达载体,此载体具有阻断NgR基因的表达的功能,为进一步研究视神经损伤基因治疗打下基础.(中华眼科杂志,2008,44:244-247)     

针对p27Kip1基因的小发夹RNA对牛角膜内皮细胞增殖的影响

目的 探讨针对p27Kip1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒对牛角膜内皮细胞(bCEC)增殖能力的影响.方法 实验研究.设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照.构建并鉴定重组质粒Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil-P3及Pgenesil-HK.以脂质体法将以上4种质粒分别转染bCEC,并设立空白组.稳定转染后采用RT-PCR和Western免疫印迹法榆测bCEC内p27Kip1的mRNA及其蛋白水平,筛选出抑制效果最好的阳性siRNA质粒.用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测该质粒组、Pgenesil-HK组及空白组的细胞生长情况.流式细胞术检测各组细胞周期的分布.以上数据结果均采用单因素方差分析.结果酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功.与空白组比较,Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil-P3各组mRNA的抑制效率分别为32.71%、67.76%及80.28%(F=453.102,P=0.000),蛋白表达水平降低为29.27%、64.73%及76.13%(F=75.385,P=0.000),以Pgenesil-P3抑制效果最明显.空白组与Pgenesil-HK组比较蛋白水平(P=0.356)和mRNA水平(P=0.246)均差异无统计学意义.与空白对照和阴性siRNA相比,Pgenesil-P3组bCEC增殖能力提高,G1期细胞比例下降(F=134.224,P=0.000),s期比例增加(F=334.957,P=0.000).结论针对p27Kip1的shRNA可有效降低p27Kip1基因及其蛋白的表达水平,并可提高bCEC增殖能力.RNA干扰介导的p27Kip1基因沉默可能是促进角膜内皮细胞再生的有效手段.(中华眼科杂志,2009,45:254-259)