鸟苷结合蛋白1对柯萨奇病毒B3及乙型肝炎病毒体外介导的不同作用

目的构建人鸟苷结合蛋白1（hGBP-1）真核表达质粒，观察hGBP-1体外对柯萨奇病毒B3（CVB3）和乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用。方法长链RT-PCR扩增全长hGBP-1编码区基因，克隆到pCR2．1TA克隆载体，再亚克隆到pcDNA3．1（-）真核表达载体。体外转染HepG2细胞和Hela细胞，Western blot检测hGBP-1的表达。然后分别观察转染细胞中hGBP-1对HBV体外复制子pHBV1．3和CVB3的抑制作用。ELISA检测共转染HepG2细胞培养L清HBsAg、HBeAg水平；Southern blot检测细胞HBVDNA复制中间体。TCID50试验检测Hela细胞培养物中CVB3感染量。结果成功构建hGBP-1真核表达质粒，能在HepG2细胞和HeLa细胞进行高效表达。该质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞，不能抑制HBV复制，HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制中间体水平与对照相比都无明显变化。转染质粒在HeLa细胞上对CVB3复制有明显的抑制作用，CVB3感染量显著降低，尤其在低剂量病毒攻击时能完全抑制CVB3复制。结论hGBP-1可能在IFN介导的抗CVB3中起重要作用，但不能抑制HBV的复制。     

MicroRNA-122作用于HBx影响乙肝病毒复制

为了寻找与HBV感染相关的microRNA并初步探讨其作用机制,首先,我们前期研究发现在转染HBV表达质粒的HepG2细胞内,miR-122上调表达,推测miR-122与HBV的感染有关;在此基础上,本研究进一步将miR-122和表达HBV的质粒pCH9-HBV1.1共转染HepG2细胞,Southern blot检测发现miR-122可抑制HBV的复制。利用计算机软件miRanda预测表明,HBx可能是miR-122的作用靶序列;进一步利用荧光素酶报告基因系统和Western blot检测靶基因HBx蛋白表达改变,验证miR-122对HBx表达的调节作用。最终推测miR-122可能通过调节HBx的表达而影响HBV的复制。     

胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G可能通过G→A突变抑制乙型肝炎病毒的复制

目的研究胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G(A3G)对HBV复制的影响及作用机制。方法利用脂质体介导A3G和HBV的真核表达质粒瞬时共转染人肝癌细胞株HepG2,以空载体pcDNA3.1与HBV真核表达质粒共转染为对照,同时转染含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒载体以判定转染效率。共转染两天后用荧光定量PCR方法定量细胞内核壳体(core)相关HBV DNA水平,用Western blot检测细胞内A3G和HBcAg的表达,并对细胞内core相关HBV DNA X基因进行PCR扩增、T-A克隆和测序,分析X基因中的碱基突变。结果经EGFP判定的转染效率平均为29%。共转染0.5μgA3G和0.5μgHBV的HepG2细胞内core相关HBV DNA量平均下降为对照的8.9%,共转染2μgA3G和0.5μgHBV的平均下降为对照的0.6%。共转染A3G和HBV表达质粒后,HepG2细胞内HBV的X基因中发生G→A突变的数目明显增多,33个克隆中有9个克隆检测到了16～37个G→A突变,突变总数达254个,而对照的33个克隆中仅有2个克隆各检测到2个G→A突变。进一步的分析发现,共转染A3G后发生的G→A突变大多集中于几个热点区域,突变靶点常在GG二核苷酸中的第一个G上。结论胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G可能通过诱导。HBV DNA的X基因发生G→A超突变,抑制HBV在人肝癌细胞HepG2中的复制。     

固有免疫分子TRIM5α对乙型肝炎病毒复制的影响

目的:构建固有免疫分子TRIM5α的真核表达质粒,研究TRIM5α 对HBV复制的影响.方法:通过巢氏RT-PCR技术从恒河猴肺组织中扩增出TRIM5α的编码基因,并将其克隆入pcDNA3.1真核表达载体.将TRIM5α真核表达质粒转染HepG2细胞,用Western blot的方法鉴定TRIM5α蛋白表达情况.将TRIM5α真核表达质粒与复制型HBV质粒通过磷酸钙沉淀法共转染HepG2细胞、通过尾静脉高压注射法共转染BALB/c小鼠.ELISA检测转染细胞上清及小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;免疫组化检测小鼠肝组织HBcAg的表达;Southern blot检测转染细胞中HBV复制中间体.将TRIM5α真核表达质粒转染293T细胞3小时后,再将基于HIV-1结构的慢病毒载体三质粒系统转染293T细胞,通过检测转染细胞上清中的HIV-1 p24抗原含量来鉴定TRIM5α抗HIV-1功能.结果:成功构建TRIM5α真核表达质粒;过表达TRIM5α不能有效降低HBV抗原和复制中间体水平,但可抑制HIV-1 p24抗原的表达.结论:TRIM5α不能有效抑制HBV的复制.     

乙型肝炎病毒对载脂蛋白A1表达的影响及其机制探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)对载脂蛋白A1( ApoA1)表达的影响及其调节机制.方法 RT-PCR和Western blot检测HepG2和HepG2.2.15中ApoA1 mRNA和蛋白的表达,全自动生化分析仪检测HBV患者和健康对照者ApoA1和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血清学水平,SPSS13.0分析其统计学差异;将HBV感染性克隆pHBV1.3与ApoA1基因启动子共转染HepG2细胞,并测定荧光素酶的活性;RT-PCR和Western blot检测HepG2细胞转染pHBV1.3后ApoA1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 HepG2.2.15细胞中ApoA1 mRNA和蛋白的表达水平较HepG2低;ApoA1和HDL-C在乙型肝炎感染者血清学水平明显低于健康对照组(P＜0.05);pHBV1.3在HepG2细胞中抑制ApoA1启动子活性、mRNA和蛋白表达.结论 HBV能够在体内外抑制ApoA1的表达.     

MXA蛋白抑制HBV复制的体外研究

目的研究MXA蛋白抑制HBV复制的活性。方法将pcDNA3．1-MXA重组质粒和PU19-1．24HBV重组质粒分别按1：1、2：1共转染HepG2细胞（MXA组），对照组使用空pcDNA3．1、Salon DNA和PU19-1．24HBV重组质粒共转染，3d后Western blot检测MXA蛋白表达，Abbott法检测细胞上清HBeAg和HBsAg分泌量，定量PCR检测上清和胞内HBV DNA水平，统计学分析结果。pcDNA3．1-MXA与PU19-1．24HBV重组质粒共转染HepG2细胞，对照组为pcDNA3．1-MXA重组质粒、PU19空质粒和Salon DNA共转染．3d后裂解细胞Western blot检测MXA蛋白表达。结果Western blot显示MXA组有MXA蛋白表达：与对照组相比，pcDNA3．1-MXA和PU19—1．24HBV重组质粒按1：1转染时，MXA组HBeAg下降27％．上清HBV DNA和细胞内HBV DNA分别下降1个log值和0．6个log值；按2：1比例转染时MXA组HBeAg较对照组下降66％，上清HBV DNA和细胞内HBV DNA水平分别下降1．9个和1．7个log值，差异均具有统计学意义（P〈0．05）。Western blot检测显示MXA蛋白抑制HBV组与对照组MXA蛋白表达没有明显差别。结论MXA蛋白在HepG2细胞具有抑制HBV复制活性，抑制活性与蛋白的表达量相关；在抑制HBV复制过程中MXA蛋白自身可能不发生降解。     

MiR-340-5p调控乙型肝炎病毒复制的机制

目的阐释miR-340-5p对HBV复制的影响及其调控机制, 并为HBV感染后的生物标志物和治疗用药提供新的策略。方法在肝癌细胞HepG2.2.15中转染miR-340-5p的模拟物(340-mimic)和抑制剂(340-inhibitor)及其对应的阴性对照。通过ELISA检测上清中HBeAg和HBsAg的水平变化。同时收取细胞, 提取RNA和壳体化DNA, 并采用qRT-PCR分别检测HBV总RNA和pgRNA的水平及HBV DNA拷贝数的变化;分子克隆构建STAT3的过表达质粒pEF-flag-stat3, 通过qRT-PCR和western blot对STAT3的mRNA和蛋白表达加以验证;此外, 共转染miR-340-5p的模拟物和pEF-flag-stat3后通过northern blot, qPCR和ELISA对HBV的复制情况进行检测。结果 miR-340-5p过表达后, HBV转录生成总RNA和逆转录模板pgRNA的水平明显下降至对照组的45.89%、61.46% (P=0.001、P=0.003);壳体化DNA的合成及HBeAg和HBsAg的分泌水平分别受到72.4...     

乙型肝炎病毒C蛋白对NK细胞功能影响的体外研究

目的 研究乙型肝炎病毒C蛋白在NK细胞中的表达及其对NK细胞功能的影响.方法 用脂质体转染法将HBV C基因真核表达载体pHBI-CMV-HBC转入NK-92细胞,通过WesternBlot检测C基因在NK-92细胞中表达,用ELISA法检测NK细胞分泌IFN-γ水平,MTT法检测NK细胞对HepG2细胞的细胞毒作用.结果 Western Blot证实转染有pHBI-CMV-HBC的NK-92细胞能表达HBV C蛋白.转染了重组真核表达质粒的NK-92细胞IFN-γ水平均高于空质粒对照组和空白对照组(P<0.01).与两对照组相比,重组真核表达质粒转染组NK-92细胞对于HepG2细胞的细胞毒活性明显提高,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 HBc基因瞬时高表达可影响NK-92细胞分泌IFN-γ和细胞毒功能.     

肝脏内源性microRNA调控乙型肝炎病毒基因的表达与复制

目的探讨肝脏内源性microRNA对乙型肝炎病毒(HBV)复制与基因表达的影响。方法通过miRNA靶点分析软件寻找与HBV序列之间相关联的肝脏内源性microRNA,体外化学合成相应的microRNA分子,将合成寡核苷酸及对照与1.3倍HBV全基因组真核表达质粒pUC18-HBV1.3采用Lipofectamine2000共转染HepG2细胞,转染48h后收集细胞培养上清;通过ELISA检测HBsAg、HBeAg的表达水平;Western印迹检测HBcAg的表达水平;Trizol抽提转染细胞RNA,逆转录后用荧光定量PCR检测HBVmRNA的水平;提取细胞基因组DNA,Southern印迹检测HBV的复制中间体。经以上检测从HBV蛋白表达、转录和复制水平评价相应的microRNA作用效应。结果生物信息学方法提示miR-16和miR-122存在与HBV基因组作用的可能结合位点。经试验初步证实miR-16可下调HBV蛋白的表达及HBVDNA水平;miR-122可下调HBsAg、HBeAg的表达,上调HBVmRNA的水平。结论肝脏内源性microRNA可以调节HBV的复制与基因表达。     

利用RNA干扰技术干扰HBeAg表达的研究

构建针对乙肝病毒HBeAg前c/c区(HBV prec/c)的短发夹环RNA(shRNA)质粒(psiHBV),观察其在体内外对HBV复制的抑制作用。构建RNA干扰真核表达载体psiHBV,与1.5倍HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染HeLa细胞,用微粒子化学发光分析仪(MEIA)分别检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达水平;用半定量PCR检测prec/cmRNA的转录情况。随后用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型。采用此感染模型,将pHBV1.5与在体外实验筛选到有明显抑制作用的shRNA表达载体(psiHBV4)共注射,注射后第6天用同样方法检测其干扰效果。结果显示,成功构建了针对HBV前c/c区的shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6及无关shRNA表达载体psiC,筛选到在体外对HBeAg有明显的抑制作用的psiHBV4载体;注射pHBV1.5的动物血清高表达HBsAg和HBeAg。而共注射干扰性psiHBV4明显抑制了HBeAg的表达,与单纯感染组相比有显著差异,RT-PCR显示肝内HBV C mRNA水平亦明显降低。上述结果表明,siRNA能特异抑制HBV的复制和表达,对乙型肝炎的治疗有潜在应用前景。     

C基因截短的HBV复制与包装

目的 探讨C基因截短型HBV变异体的复制与包装。方法 采用分子克隆、人工定点突变等技术构建C基因截短型HBV变异体质粒，用脂质体法转染HepG2细胞，提取细胞内及培养上清液中DNA分别进行Southem杂交，PCR及实时定量荧光PCR分析。结果 经DNA测序及酶切鉴定证实C基因截短型HBV质粒载体构建成功；C基因截短型HBV为复制缺损型，与辅助质粒共转染HepG2细胞，可在细胞内及培养上清液中检测到HBV各种DNA构型；DNA定量分析提示C基因截短型HBV的包装效率较野生型HBV提高3～40倍。结论 C基因截短型HBV变异体为复制缺损型，单独转染后不能在肝细胞内包装与复制，但在缺失包装信号ε的相应辅助病毒辅助下可有效复制并包装成子代病毒颗粒分泌到胞外，且包装效率大大提高。     

Restoration of replication phenotype of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by compensatory changes in the "fingers" subdomain of the viral polymerase selected as a consequence of mutations in the overlapping S gene

The introduction of lamivudine (LMV) for the treatment of chronic hepatitis B infection has been an important advance in the management of this disease. However, the long-term efficacy of LMV may become limited by the emergence of antiviral-resistant hepatitis B virus (HBV) mutants. The two most common LMV-resistant mutants produce changes in the viral polymerase protein (rt) of rtM204I and rtL180M/M204V (previously rtM550I and rtL526M/M550V). A number of studies have demonstrated that these HBV mutants appear to be replication impaired, both in vitro and in vivo. The detection and selection of compensatory mutations in the polymerase protein that restore the replication phenotype of these HBV mutants have been poorly described to date. The effects of mutations in the fingers subdomain of the viral polymerase protein arising as a consequence of vaccine and hepatitis B immune globulin (HBIg) selected changes in the overlapping envelope gene (S), and a determinant of the hepatitis Bs antigen (HBsAg) were analyzed in vitro. The LMV-resistant HBV mutants rtM204I and rtL180M/M204V produced substantially weaker HBV DNA replicative intermediate signals by Southern blot analysis and less total intracellular HBV DNA by real-time PCR compared to wild-type virus. The viral polymerase protein of these mutants produced little detectable radiolabeled HBV DNA in an endogenous polymerase assay. In contrast, the HBV a determinant HBIg/vaccine escape mutants sP120T, sT123N, sG145R, and sD144E/G145R (that produce rtT128N, Q130P, rtW153Q, and rtG153E respectively) yielded as much virus as wild-type HBV while the sM133L (rtY141S) mutant was replication impaired. Two of these mutants, rtT128N and rtW153Q, when introduced into a replication-competent HBV vector containing the rtL180M/M204V polymerase mutation restored the replication phenotype of this LMV-resistant mutant. These viruses produced levels of intracellular HBV DNA as determined by Southern blot and real-time PCR that were comparable to those of wild-type HBV, indicating that the changes in the fingers subdomain were able to compensate for the reduced replication of the LMV-resistant mutations. Since these viruses carry mutations in the a determinant of HBsAg that may potentially decrease the ability of anti-HBs antibody to neutralize these viruses, these HBV mutants also have the potential to behave as vaccine escape mutants.     

APOBEC3F的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的克隆、体外真核表达载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)基因并研究其抗病毒效应。方法应用RT-PCR的方法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3F基因,构建HA-APOBEC3F融合蛋白真核表达载体pXFA3F,pXFA3F和具有复制能力的1.3倍HBV载体pHBV1.3共转染HepG2细胞,Western印迹检测APOBEC3F融合蛋白在HepG2细胞中的表达,ELISA方法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果克隆了APOBEC3F基因,其经测序与GeneBank公布序列一致;构建的APOBEC3F真核表达载体pXFA3F经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;APOBEC3F可抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,可使转染细胞内HBV相关mRNA水平下降。结论成功克隆并真核表达了APOBEC3F基因,其在体外具有抗HBV生物学效应。     

乙型肝炎患者HBV M和HBV DNA的相关性研究

目的 探讨乙型肝炎患者的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）血清学标志（ＨＢＶ Ｍ）与ＨＢＶ ＤＮＡ检测结果的相关性与临床意义。方法 对４１４例乙型肝炎的ＨＢＶ Ｍ和ＨＢＶ ＤＮＡ检测结果进行比较。ＨＢＶ Ｍ用ＥＬＩＳＡ定量分析法检测,ＨＢＶ ＤＮＡ用斑点杂交法检测。结果 急性、慢性乙型肝炎患者中ＨＢＶ ＤＮＡ的阳性率与乙型肝炎肝硬化患者的ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率比较,差异有显著性;ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ阳性和ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｃ阳性组的ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率比较,差异无显著性;ＨＢｓＡｇ和／或ＨＢｅＡｇ的滴度与ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率呈正相关关系。结论 ＨＢＶ ＤＮＡ是评价ＨＢＶ活动最理想的标志;抗－ＨＢｅ的出现不能作为ＨＢＶ复制停止的指标;ＨＢｓＡｇ的滴度和ＨＢｅＡｇ的滴度变化可作为临床评价病毒复制程度和     

Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus

Hepatitis B virus core (HBc) particles, self-assemble into capsid particles and are extremely immunogenic, hold promise as an immune-enhancing vaccine carrier for heterologous antigens. However, formation of virus-like particles (VLP) can be restricted by size and structure of heterlogous antigens. In the study, we investigated formation of VLP by modified HBc fused with specified foot-and-mouth disease virus (FMDV) multiepitopes and evaluated their immune effects. Firstly, three HBc display vectors (pHBc1, pHBc2 and pHBc3) were constructed by deletions of different lengths within the HBc c/e1 region: 75-78 amino acid (aa), 75-80 aa and 75-82 aa respectively. Secondly, we inserted different compositions of FMDV multiepitopes, BT [VP1(141-160)-VP4(21-40)] and BTB [VP1(141-160)-VP4(21-40)-VP1(141-160)], into modified regions. As a result, only plasmid pHBc3-BTB of six recombinant vectors was expressed as soluble protein, which resulted in the formation of complete VLP confirmed by electron microscopy. Recombinant VLP could be taken up by cells and presented in vitro and in vivo. Furthermore, the modified VLP displayed a significantly stronger immunogenicity than other five recombinant proteins and GST-BTB with a higher titer of peptide-specific and virus-specific antibody, elevated IFN-gamma and interleukin-4 production, especially enhanced lymphocyte proliferation. The results encourage further work towards the development of FMDV vaccines using hepatitis B virus core particles fused with FMDV epitopes.     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。     

S基因显性阴性突变体干扰乙肝病毒颗粒组装的研究

目的　探讨S基因突变对HBV病毒颗粒组装的影响。方法　构建野生型S基因、S基因突变的真核表达载体pcDNA3 S和pcDNA3 mS及S基因突变的全长HBV基因组表达载体pHBV mS ,用pHBV mS与pcDNA3 S共转染HepG2细胞 ,pHBV mS与pcDNA3共转染HepG2细胞 ,以adwR9与pcDNA3共转染为对照 ;pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞 ,以adwR9和pcDNA3共转染为对照 ,用荧光定量PCR检测胞内和上清中病毒量 ,用ELISA方法检测上清中S抗原。结果　pHBV mS与pcDNA3共转染组上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量二者相同。pHBV mS与pcDNA3 S共转染组上清、胞内病毒量与对照组相同。pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞其上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量两者相同。上清中S抗原实验组较对照组低。结论　S突变体干扰HBV病毒颗粒的组装 ,导致的HBV病毒颗粒分泌下降。     

霉酚酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

目的:探讨霉酚酸（MPA）在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。 方法:将不同浓度的MPA（1-20 mg/L）作用于HepG2.2.15细胞，在外加或不加鸟嘌呤核苷（简称鸟苷）的情况下，分别收集第4 d细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg），采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测细胞内乙型肝炎病毒核心蛋白mRNA（HBV core mRNA）,狭缝印迹杂交法定量分析细胞内 HBV DNA。 结果:在不外加鸟苷情况下，MPA对HBV复制具有抑制作用，随着浓度增加，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBV DNA复制水平下降。外加鸟苷后能逆转MPA对HBV复制的抑制作用。 结论:MPA对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌及HBV DNA复制具有抑制作用。MPA可能通过减少细胞内鸟苷酸的合成来实现对HBV复制的抑制。