IGF-1R、PRKCZ基因启动子区甲基化检测方法的探讨

目的 探讨人和小鼠的IG-1R 、PRKCZ基因启动子区DNA甲基化检测的方法.方法 用亚硫酸氢钠处理人外周血白细胞基因组DNA及小鼠骨骼肌组织中DNA标本,以修饰后的DNA为模板,对人和小鼠两个不同基因分别设计合适的引物对启动子区进行Touch-Down PCR扩增,PCR产物进行克隆测序.结果 在利用合适的引物对修饰后DNA模板进行扩增时均能扩增出目的 片段,克隆测序结果显示IGF-1R、PRKCZ基因启动子区甲基化的胞嘧啶碱基C不变,而非甲基化的胞嘧啶碱基C转变为胸腺嘧啶碱基T.结论 成功的建立了人和小鼠IGF-1R、PRKCZ基因启动子区甲基化的检测方法,为进一步探讨这两种基因启动子区甲基化与相关疾病的关系奠定基础.     

CTNNA1基因启动子区异常甲基化与急性髓系白血病的相关性分析

目的研究CTNNA1基因启动子区异常甲基化与急性髓系白血病(AML)发生的相关性。方法选取180例AML患者骨髓标本及24例健康供者骨髓标本,通过甲基化特异性PCR方法(MS-PCR)进行CTNNA1基因启动子区异常甲基化阳性率进行检测,提取基因组DNA,设计硫化测序PCR(BS-PCR)引物及甲基化特异性PCR(MS-PCR)引物,进行PCR扩增及测序分析。结果 5例健康者标本及5例AML患者标本DNA经硫化且BS-PCR测序分析,其健康者标本甲基化率分别为1.5%、1.0%、1.0%、1.5%、1.0%,而AML患者CTNNA1甲基化率分别为92.0%、78.5%、86.0%、56.0%、90.0%,远远高于健康供者。MS-PCR分析结果显示,CTNNA1基因在24例健康人中呈完全非甲基化状态,在180例AML患者中其甲基化阳性率为37.2%(P0.05)。结论 CTNNA1基因启动子区异常甲基化可能参与AML的发生,为疾病的早期监测提供分子理论依据。     

25例白血病患者TES基因启动子区甲基化状态的研究

目的研究白血病患者骨髓中Testin蛋白(TES)基因启动子区甲基化状态,探讨TES基因与白血病的关系。方法以13例原发急性髓系白血病和12例急性淋巴系白血病患者的骨髓标本为研究对象,以15例健康者骨髓标本作对照,采用焦磷酸甲基化测序(BSP)方法检测骨髓中TES基因启动子的甲基化水平,分析健康者与白血病患者之间甲基化状态,以及不同类型白血病之间TES基因启动子区甲基化状态是否存在差异。结果 25例白血病患者骨髓标本中共有21例TES基因启动子区高甲基化,阳性率为84.0%。15例健康者骨髓标本均未检测到TES基因启动子区甲基化。12例急性淋巴系白血病患者骨髓标本中TES基因启动子区甲基化率为83.3%;13例原发急性髓系白血病患者骨髓标本中TES基因启动子区甲基化率为84.6%,二者差异无统计学意义(P0.05)。结论 TES基因启动子区甲基化检测可能成为白血病诊断的生物标志物之一。     

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34＋细胞和正常人外周血单个核细胞（PBMNC）中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT—PCR检测脐血CD34＋细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34＋细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNc不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论：HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXIM在CD34＋细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。     

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的　介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法　将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果　在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论　筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

ID4基因高甲基化与乳腺癌相关性研究

目的观察乳腺癌中DNA结合抑制因子4(ID4)基因启动子区甲基化状态及其与临床病理特征间的关系,探讨ID4基因在乳腺癌发病过程中的作用机制。方法采用焦磷酸测序法定量检测乳腺癌及正常组织标本中ID4基因启动子区甲基化水平,并分析其在不同临床病理特征间的差异;用RT-PCR检测MM-453细胞去甲基化处理前后ID4启动子区甲基化水平及mRNA表达情况。结果乳腺癌组织中ID4启动子区甲基化水平显著高于正常乳腺组织[(31.16±1.50)%vs(19.89±0.22)%,P0.01];ER+乳腺癌组织中ID4甲基化水平显著高于ER-乳腺癌组织[(36.57±1.97)%vs(27.91±1.83)%,P0.01];去甲基化处理后MM-453细胞ID4甲基化水平明显下降,mRNA表达显著上升,两者呈负相关(r=-0.973,P0.01)。结论 ID4基因可能通过启动子区高甲基化等多种途径在乳腺癌发生、发展过程中起着重要作用,其启动子区高甲基化在ER+的乳腺癌中具有重要意义。     

芯片技术用于APC基因启动子甲基化定量检测

目的研制抑癌基因APC启动子1A的甲基化定量检测芯片,对临床标本进行初步定量检测分析。方法采用脐带血DNA克隆体作为阴性、阳性质控品建立芯片,提取6例健康人的肺组织DNA、6例肺癌患者的肺组织和癌组织DNA,进行亚硫酸盐化学修饰,以甲基化特异性引物进行基因扩增,与探针杂交检测,并进行甲基化特异性序列分析。结果甲基化阳性、阴性质控品的芯片检测与测序结果吻合。687、707、714、719和726共5个位点的荧光强度标准曲线的R2为0．93-0．99。687、707、714、719和726共5个位点非甲基化的检测范围:(0±8．7)％、(0±17．6)％、(0±17)％、(0±13)％、(0±8)％;甲基化杂合型的检测范围:(50±3．6)％、(50±6．9)％、(50±3．5)％、(50±8．5)％、(50±7．3)％。标本的芯片检测与测序结果一致。结论本研究首次建立了以微阵列技术为基础的APC基因启动子甲基化定量检测芯片。     

亚硫酸氢盐测序法检测上皮钙黏蛋白甲基化的优化探讨

目的探讨改进的亚硫酸氢盐测序法在上皮钙黏蛋白甲基化检测中的可行性。方法提取雄性F344大鼠肾脏组织基因组DNA,亚硫酸氢盐化学转化,通过PCR扩增上皮钙黏蛋白基因启动子区特定的序列,以蓝白克隆斑筛选和测序。结果雄性F344大鼠肾脏上皮钙黏蛋白基因启动子区CpG岛的26个CpG位点均未发生甲基化。结论改进后亚硫酸氢盐测序法能明显减少非特异性扩增,提高PCR效率,更适于基因甲基化状态的检测。     

藏、汉族EPAS1基因启动子区DNA甲基化的差异研究

目的对比世居高原藏族、世居平原汉族及久居高原汉族中EPAS1基因启动子区DNA甲基化水平差异,分析EPAS1基因DNA甲基化在高原低氧适应中的可能作用。方法世居高原藏族、世居平原汉族及久居高原汉族健康男性志愿者各10例,采集EDTA抗凝外周血,提取血液基因组DNA,采用Agena MassArray核酸质谱技术定量检测平原汉族、久居高原汉族及高原藏族3组人群中DNA甲基化程度的差异。提取上述分组血液样本总RNA,反转录为cDNA,qRT-PCR技术检测不同组EPAS1基因表达量的差异。结果平原汉族、久居高原汉族及高原藏族人群中EPAS1基因启动子区整体DNA甲基化程度分别为8.87%±10.31%、7.17%±10.12%、9.32%±13.07%,3组人群中均无统计学差异(P0.05);EPAS1基因启动子区部分CpG位点的甲基化程度在3组人群中存在显著差异(P0.05);EPAS1基因rs13419896、rs1868092及rs4953354位点序列突变与3组人群的DNA甲基化程度无统计学差异(P0.05)。久居高原汉族EPAS1基因mRNA表达量显著高于平原汉族,世居高原藏族略高于平原汉族。结论 EPAS1基因启动子区部分CpG位点的DNA甲基化水平在藏、汉族中存在差异,久居高原汉族可能通过DNA甲基化的改变来适应高原低氧环境。     

DNA甲基化调控K562细胞系kir3dl1基因表达

为分析kir3dl1基因启动子区的甲基化模式及其与基因表达的关系，探讨kir3dl1基因的表达调控机制，采用亚硫酸氢盐测序法检测K562细胞中kir3dl1基因启动子区的甲基化状况，应用甲基化抑制剂5．氮胞苷处理K562细胞以诱导CpG岛去甲基化，观察启动子区CpG岛甲基化与kir3dl1基因表达的关系。结果显示：K562细胞中kir3dl1基因核心启动子区CpG二核苷酸甲基化频率在20％-100％之间；K562细胞中kir3dl1基因启动子序列在转录因子E2F可能的结合位点上存在1个碱基的突变，并形成1个新的被甲基化的CpG二核苷酸；应用甲基化抑制剂5．氮胞苷可以诱导不表达kir3dl1基因的K562细胞重新表达该基因。结论：K562细胞中kir3dl1基因表达受启动子甲基化调控，对转录因子E2F的深入研究有助于了解其在kir3dl1基因表达调控中可能的作用。     

熔解曲线法用于肺癌APC基因甲基化模式的研究

目的 以熔解曲线法测定4株肺癌细胞株和肺癌病人APC基因启动子区的甲基化模式.方法 以脐血淋巴细胞DNA及其转甲基后的DNA经化学修饰、克隆测序的质粒,作为完全非甲基化和完全甲基化标准品.设计通用引物,采用加入荧光染料SYBR Green I的荧光定量PCR法扩增包含21个CpG位点的APC基因启动子区的目的序列,以熔解曲线法通过与完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值比较,确定四株肺癌细胞株(NCI-H446,NCI-H460,SPCA1,NCI-H520)在该区段的甲基化模式,并通过克隆测序验证.同时测定两例肺癌患者癌组织中APC基因启动子区甲基化模式.结果 四株肺癌细胞株中,NCI-H446,SPCA1和NCI-H520的Tm值与完全非甲基化标准品的Tm值相同,而NCI-H460的Tm值有两个,分别与完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值吻合,并经克隆测序验证.两例肺癌患者癌组织的Tm值位于完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值之间.结论 小细胞肺癌细胞株NCI-H446,肺腺癌细胞株SPCA1和肺鳞癌细胞株NCI-H520的APC基因启动子区为完全未甲基化型,而大细胞肺癌细胞株NCI-H460APC基因启动子区甲基化模式为等位基因杂合型.两例肺癌患者癌组织中的APC基因启动子均为部分甲基化型.熔解曲线法是简单、经济和实用的甲基化模式检测方法.     

痰标本p16基因启动子区甲基化联合血清细胞角蛋白19片段和癌抗原15-3对非小细胞肺癌的诊断价值

目的 评价痰液标本中p16基因启动子区甲基化联合血清中细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment,CYFRA 21-1)和癌抗原15-3(CA15-3)的检测对非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断价值.方法 用巢式甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测100例NSCLC患者痰液p16基因启动子区甲基化联合化学发光法检测患者血清中CYFRA21-1和CA15-3的水平,评价3种肿瘤标志物联合检测对NSCLC的诊断价值.结果 NSCLC患者痰液中p16基因启动子区甲基化阳性率为61.0%;NZCLC患者血清中CYFRA21-1和CA15-3的实验敏感度分别为58.0%和38.0%;联合检测可明显提高NSCLC的检出率,敏感度79.0%,明显高于各种肿瘤标志物单项检测.结论 痰液标本中p16基因启动子区甲基化联合血清中CYFRA21-1和CA15-3的检测可明显提高NSCLC的检出率,为早期诊断NSCLC提供了依据.     

首发精神分裂症患者外周血Reelin基因甲基化检测

目的通过精神分裂症患者外周血中Reelin基因启动子区DNA甲基化状态的研究,探讨DNA甲基化与精神分裂症的关联。方法收集精神分裂症患者76例(患者组)和健康对照者60例(健康对照组),采用甲基化特异性PCR方法检测Reelin基因启动子区DNA甲基化状态。结果患者组甲基化阳性率为78.95%(60例),健康对照组甲基化阳性率为35%(21例),两组差异有统计学意义(χ2=4.971,P=0.026);Logistic回归分析显示,Reelin基因甲基化与精神分裂症有关(OR=13.084,95%CI:5.079~26.308)。结论 Reelin基因启动子区DNA甲基化与精神分裂症有关,精神分裂症患者外周血中Reelin基因启动子区DNA呈超甲基化状态,Reelin基因DNA甲基化是精神分裂症的危险因素。     

ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性

近年来研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关，某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象已日益引起关注。本研究探讨ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性。采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了不同血型的健康人群和各种血液病患者外周血红细胞表面ABH抗原的相对含量，用PCR和MSP—PCR分别检测血液病患者和健康人ABO基因启动子DNA序列和CpG岛甲基化，以及ABO基因启动子-102位点的甲基化。结果发现，白血病患者均出现不同程度的A、B抗原减少；通过对比检测健康人和患者的ABO基因启动子序列，未发现有序列的不同，说明启动子序列高度保守；利用重亚硫酸盐对DNA样本进行修饰后，通过对健康人和患者的ABO基因启动子序列进行扩增和测序，发现健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点，而急性髓性白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性粒细胞白血病（CML）和部分骨髓增生异常综合征（MDS）患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基均有甲基化的现象。结论：甲基化是造成白血病患者AB抗原下降的原因；-102、-101、-100、-99和-97这几个甲基化位点有可能是白血病的特异性表现；针对-102住点检测结果提示-102位点是否甲基化有可能作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物。     

K562和K562/DNR细胞中mdr1基因启动子甲基化状态的分析

目的　分析K5 6 2和K5 6 2 /DNR细胞中mdr1基因启动子甲基化模式及其与P gp表达的关系。方法　用流式细胞术和RT PCR方法检测两个细胞系中mdr1基因的表达 ,用亚硫酸氢钠脱氨基 DNA测序的方法分析mdr1基因启动子甲基化模式。结果　K5 6 2细胞不表达P gp ,mdr1基因启动子甲基化 ;K5 6 2 /DNR细胞P gp表达阳性 ,mdr1基因启动子非甲基化。 结论　K5 6 2和K5 6 2 /DNR细胞mdr1基因启动子甲基化模式不同 ,前者有甲基化修饰 ,后者无甲基化修饰 ,mdr1基因沉默与其启动子甲基化有关     

荧光杂交探针实时聚合酶链式反应快速检测甘露聚糖结合凝集素启动子区基因变异方法的建立

目的建立用荧光杂交探针实时聚合酶链式反应（Real-timePCR）检测人甘露聚糖结合凝集素（MBL）启动子区基因变异新型的基因分型法——Tm基因分型法。方法收集30例健康献血员外周抗凝全血,提取基因组DNA。通过LightCycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线,根据熔解温度（Tm）峰值判定待测标本的基因变异类型。最后,用基因测序法检测PCR产物来验证Tm基因分型法的准确性。结果建立了新型的Tm基因分型法,且测定PCR产物的时间仅180min,检测结果与测序法完全吻合。结论Tm基因分型法检测人MBL启动子区基因变异快速、准确,重复性好,具有广泛的临床应用前景。     

B弱亚型表达调控的分子机制研究

目的 研究B抗原减弱血液标本的血清学特性和抗原表达减弱的分子机制.方法 选择2007年1月至2010年12月于本中心行常规ABO血型检测样本中,B抗原表达减弱的血液样本10份作为研究对象,纳入研究组;计算机随机选择5份正常B表现型的血液样本作为对照组.采用经典血清学技术检测红细胞ABO血型,聚合酶链反应(PCR)技术扩增ABO基因全部外显子序列和5’端调控(CBF/NF-Y增强子)序列,并进行测序分析,应用逆转录-PCR(RT-PCR)技术分析ABO cDNA转录剪接情况,采用重亚硫酸盐转化和克隆测序法分析ABO基因启动子区CpG岛甲基化水平.结果 研究组标本的血清学表现为B抗原明显减弱,全部外显子编码序列和拼接位点碱基无任何突变.ABO基因增强子未发现异常,存在着ABO基因全长cDNA转录本,未发现新的转录剪接体.与对照组比较,研究组10份标本在启动子区CpG岛均呈现不同程度的甲基化,其中6个标本在nt-26序列位点表现半甲基化状态.结论 ABO基因启动子区CpG岛中的甲基化位点可能是引起B抗原弱表达的原因.     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究

本研究应用改进的甲基化特异性PCR（MSP）法，即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率，探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株，及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰，再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增，分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明：CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化，而Molt4、K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论：用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态，方法简单，灵敏且重复性强，可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应（PCR），并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7，提取基因组DNA，利用亚硫酸氢盐测序法，用常规、降落及改进PCR分别扩增，比较扩增效果，PCR产物纯化回收后，TA克隆入载体pGEM-T，转化大肠杆菌（E．coli DH5α），筛选阳性克降，经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒，测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比，扩增效率增高，二聚体及非特异性扩增减少；测序结果显示，MCF-7细胞基因组DNA中，RASSFIA基因启动子CpG岛是高甲基化的，E-cadherin基因启动子CpG岛末呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性，更适用于基因甲基化状态的检测，并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。