人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.     

EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-2A,脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体;筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆;收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L,且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

人p58.2重组逆转录病毒载体的构建及稳定包装细胞系的鉴定

目的　构建并鉴定携带人p5 8 2基因的重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　用PCR技术从pSPORT1-p5 8 2扩增出编码p5 8 2N端 1～ 3 45个氨基酸的全长基因 ,定向克隆入逆转录病毒载体pMSCVneo中 ,酶切鉴定 ;脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果　双酶切鉴定 ,成功构建重组逆转录病毒载体 ;重组逆录病毒载体转入包装细胞 ,经G418筛选 ,形成了抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 3×10 5cfu/ml,提示构建携带人p5 8 2基因的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论　构建人p5 8 2基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对血液系统疾病进行基因治疗的方法     

人NT-3重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞系的构建及鉴定

构建并鉴定携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系。方法 :用DNA重组技术将人NT - 3定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN ,并用限制性内切酶进行酶切鉴定 ;磷酸钙转染方法将重组的逆转录病毒转染入包装细胞系PA317,G4 18筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 :构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切开 ,电泳分离显示两条阳性条带 ,分别出现于 0 .8kb和 5 .9kb处 ;重组载体转染包装细胞 ,经G4 18筛选 ,可形成抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 4× 10 5cfu/ml,提示构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论 :构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对神经系统疾病进行基因治疗的方法。     

葡萄糖转运蛋白-2逆转录病毒表达载体构建/包装及其鉴定

目的 构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础.方法 质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;转pL-GLUT2-SN至包装细胞系PA317,G418抗性筛选,检测上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆行PCR及RT-PCR鉴定.结果 建立GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;所建稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT2,其最高病毒滴度达7.1×105 CFU/ml,PCR及RT-PCR证实GLUT-2基因整合入其中并稳定表达.结论 成功构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为"人工胰岛β细胞"的构建奠定了基础.     

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

【目的】 探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】 用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1-tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】 经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×10~4 cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC-7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC-7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC-7901/tk有明显杀伤作用,对SGC-7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1-tk基因,表达产物具有生物活性。【结论】 将HSV1-tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1-tk(基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

逆转录病毒介导的SHP-1基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的 构建逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1.获取重组逆转录病毒.并将SHP-1基因转导入乳腺癌MDA-MB-231细胞株.方法 采用RT-PCR方法从高表达SHP-1的人乳腺癌细胞株MCF-7中克隆出SHP-1基因全长cDNA,构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,通过脂质体介导将其转染入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.采用Western blotting方法检测SHP-1基因在MDA-MB-231细胞中的表达情况.结果 成功构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,转染包装细胞PT67,筛选出对G418具有稳定抗性的克隆PT67/SHP-1,获取重组逆转录病毒上清液,并感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.从蛋白水平证实,感染后的MDA-MB-231有SHP-1基因的表达.结论 将SHP-1基因定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取重组逆转录病毒,感染MDA-MB-231细胞得到稳定表达SHP-1基因MDA-MB-231/SHP-1,为进一步研究奠定了基础.     

加温对小白鼠染色体影响的研究

加温是一种对放疗中射线抵抗性细胞增敏的有效方法。加温是否对机体有损伤目前很少有人探讨。本文利用微波辐射、恒温水浴为热源对小白鼠加温,观察细胞染色体的改变,判定热疗过程对机体的损伤。     

100例子宫肌瘤与子宫腺肌病的B超图像分析

目的 探讨子宫肌瘤与子宫腺肌病Ｂ超图像特征及其鉴别诊断。方法 常规Ｂ超检查,并将子宫肌瘤子宫腺肌病两组Ｂ超图像进行比较分析。结果 ４７例肌瘤（９４．０％）有假包膜或界限清楚,。２８例腺肌病（９３．３％）界限欠清;４１例肌瘤（８２．０％）探及栅栏样图像和后方回声衰减仅各有２例（６．６７％）、１８例（６０．０％）呈高回声,两者比较差异有显著性（Ｐ〈０．０１,〈０．０５）。结论：Ｂ超对子宫肌瘤和腺肌病的     

伤立效总提取物对小白鼠骨骼肌微循环障碍的影响

实验表明,伤立效对肾上腺素所致的小白鼠骨骼肌微循环障碍具有扩张微血管口径、加快微血管的血流速度、增加血流量的作用,实验组与对照组比较,各项指标差异均非常显著(P<0.01)。     

鼻咽癌放疗后复发因素分析（附30例报告）

本文总结了1988－1993年30例鼻咽癌放疗后复发因素，包括剂量因素，边缘因素，病情估计不足及设野不合理等，其中病情估计不足造成的复发，占33．3％（10／30），克服病情估计不足，改进放疗设野布局，有进一步提高鼻咽癌的治愈率和降低复发率的可能，CT检查应列为鼻咽癌的常规检查。     

外阴部血管瘤21例治疗分析

目的：探讨女性外阴血管瘤的治疗方法及时机。方法：对1994-1999年收治的14例女性外阴部血管瘤和7例海绵状血管瘤，分别采用平阳霉素局部注射和手术切除治疗。结果：毛细血管瘤全部治愈，海绵状血管瘤复发率为28.6%(2/7)，1例出现部分皮拉坏死并发症。结论：女性外阴部毛细血管瘤不宜在观察中等其自然消退，应积极采用平阳霉素瘤内注射治疗，海绵状血管瘤单纯用平阳霉素注射治疗效果不佳，宜采用手术切除。     

胃去门静脉循环断流术犬模型的建立

目的设计胃去门静脉循环断流术的方法 ,并建立胃去门静脉循环断流术犬模型。方法应用缩窄门静脉主干1/2加丝线慢性栓塞术制作犬肝前型门静脉高压食管静脉曲张模型。然后,实施胃去门静脉循环断流术,即行脾切除后,保留贲门周围血管、食管曲张静脉及迷走神经,从根部离断胃冠状静脉等汇入门静脉系统的胃静脉血管,使胃的静脉血流经门奇间的交通支血管进入体循环。将已形成肝前型门静脉高压食管静脉曲张犬12只随机分为脾切除组、贲门周围血管离断术组、胃去门静脉循环断流术组。于开腹后、手术后即刻及术后3周末测量门静脉及食管曲张静脉压力。术前及术后3周末测定肝功能指标。结果犬模型均存活。手术后即刻及术后3周末与开腹后相比,胃去门静脉循环断流术组门静脉压力显著下降(F=7.386,q=3.503、3.121,P<0.05);食管曲张静脉压力亦显著下降(F=8.026,q=3.661、3.240,P<0.05)。手术前后肝功能指标变化不明显(t=0.268～1.325,P>0.05)。结论胃去门静脉循环断流术犬模型存活率高,制作方法简单易行,模型质量可靠,有助于研究胃去门静脉循环断流术对门静脉血流动力学参数的影响。     

手术治疗甲状腺机能亢进93例临床分析

目的：探讨我院所作甲状腺机能亢进的甲状腺次全切除术病例的经验教训。方法：将本院28年来外科施行的93例甲亢的甲状腺次全切除术病例资料进行回顾性分析。结果：男8例,女85例,发病年龄男15～56岁,平均36岁;女16～70岁,平均34岁。肿块大小为3～20厘米,16厘米以上占77.42%,病理诊断：弥漫性毒性甲状腺肿92例,双侧结节性毒性甲状腺肿1例。基础代谢率27%～73%,平均46.3%。心电图异常50例占53.76%。术后1例并发甲亢危象,1例并发甲低,房室传导阻滞,均痊愈出院。结论：甲亢的甲状腺次全切除术效果可靠,优于药物治疗,并发症少,术前准备要仔细充分,术中操作要细致,严防并发症的发生,特别是甲低、甲亢危象,旁腺和神经损伤的发生。     

不同冷冻时间对兔角膜膨胀率的影响

对不同冷冻时间（２０ｓ和３ｍｉｎ）及不同方法保存的兔角膜膨胀率进行了测定。结果冷冻２０ｓ及３ｍｉｎ，新鲜角膜组膨胀率（％）分别为２９．４５±１．９，４９．７４±１．６（Ｐ＜０．０５）；冷冻保存组为３１．６５±０．８及５４．６７±２．７（Ｐ＜０．０５）；干燥保存组为７３．８２±７．７及８６．０９±１．３（Ｐ＜０．０５）。干燥保存组角膜膨胀率与新鲜组及冷冻保存组差异均有显著性（Ｐ＜０．０１）。提示在角膜组织镜片加工时，应考虑不同保存方法和不同冷冻时间所造成的不同膨胀率对其厚度的影响，从而减少镜片加工时的屈光度误差。     

手术治疗支气管类癌30例临床观察

目的分析支气管类癌的临床特征,探讨手术治疗的方法和影响预后的因素。方法进行回顾性分析经手术切除的30例支气管类癌病的影像学特征、临床表现及影响预后的因素。结果术后病理证实,21例为典型支气管类癌,9例为非典型支气管类癌;手术治疗后21例病人存活超过5年,其中10例超过10年;4例3年内死于肝脑转移,5例术后不足5年,仍健在。结论相对于其他类型的肺癌,支气管类癌具有良好的生物学特性及预后。手术是治疗支气管类癌的主要方法,远处转移是影响预后的主要因素。     

甲状腺癌28例误诊原因分析

甲状腺癌误诊的常见原因是对其发病特点认识不足,术前临床资料不■实,术中处理不够慎重。为减少临床误诊应采取综合措施。包括提高对此病诊断的警惕性,认真行颈部触诊,综合分析各项检查结果,依靠穿刺细胞学检查和术中冰冻切片以及石蜡块组织学检查而最后确诊。