多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌

目的　建立耐异烟肼 (isoniazid ,INH )结核分枝杆菌多重聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (multiple polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,multi PCR SSCP)方法 ,快速、特异地同时检出aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况 ,用于快速诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性。方法　根据结核分枝杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列 ,分别设计出 3对特异性寡聚核苷酸引物 ,采用multi PCR及SSCP技术 ,同时检测对结核分枝杆菌耐INH起作用的这 3个基因的突变情况。结果　对H3 7Rv标准株、临床分离INH敏感株 (2 3株 )及INH耐药株 (3 5株 )分别采用常规PCR和multi PCR同时进行扩增 ,两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段 ,且结果符合率达10 0 % ;采用单基因PCR SSCP ,aphC启动子序列突变检出率 17% (6/3 5)、inhA序列突变检出率 2 0 % (7/3 5)、katG序列突变检出率 66% (2 3 /3 5) ;multi PCR SSCP突变检出率 83 % (2 9/3 5)。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,multi PCR SSCP方法敏感、特异 ,能同时快速有效地检测结核分枝杆菌aphC启动子、inhA、katG 3个INH耐药基因的突变 ,提高检验效率 ,有望成为临床指导用药的好方法。     

噬菌体生物扩增法、DNA序列分析及单链构象多态性分析检测结核分枝杆菌耐药性

目的　探讨和评价噬菌体生物扩增技术 (phageamplifiedbiologicallyassay,PhaB)用于检测结核分枝杆菌耐药性的应用价值。方法　本研究共选取了 91株利福平 (RFP)耐药株 (其中 82株为耐多药结核分枝杆菌 )、4 2株RFP敏感株、75株氧氟沙星 (OFLX)耐药株、4 0株OFLX敏感株 ,应用PhaB、DNA序列分析法和聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP) 3种检测方法 ,同时对同一菌株应用该 3种方法进行耐药性检测 ,以资分析与评价PhaB法的临床应用价值。结果　以绝对浓度法药敏试验结果为标准 ,检测RFP的药物敏感性 ,PhaB法的准确性为 93% ,敏感性为 92 % ,特异性为95 % ;DNA序列分析法的准确性为 93% ,敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;PCR SSCP法的准确性为90 % ,敏感性为 86 % ,特异性为 10 0 %。检测OFLX(OFLX)的药物敏感性 ,PhaB的准确性为 95 % ,敏感性为 95 % ,特异性为 95 % ;DNA序列分析法的准确性为 80 % ,敏感性为 71% ,特异性为 98% ;而PCR SSCP法的准确性为 75 % ,敏感性为 6 3% ,特异性为 98%。结论　PhaB法是一种操作简便、快速、敏感、与绝对浓度法符合率高的结核分枝杆菌耐药性检测方法 ,在 4 8～ 96h内可获得试验结果 ,具有良好的临床应用前景。     

应用反向斑点杂交技术快速鉴定脊柱结核分枝杆菌菌种

目的探讨反向斑点杂交技术在脊柱结核分枝杆菌菌种鉴定中的应用价值。方法通过16SrDNA聚合酶链反应一单链构象多态性（polymerasechainreaction—singlestrandconformationpolymorphism,PCR—SSCP）分析鉴定37例脊柱结核术后患者病理组织或脓液抗酸染色阳性标本的分枝杆菌菌种;设计与合成用于鉴定分枝杆菌菌种的16SrDNA寡核苷酸探针,制作硝酸纤维膜微阵列,与待鉴定菌株生物素标记的16SrDNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果37例脊柱结核标本中,经16SrDNAPCR—SSCP初步鉴定,36株为结核分枝杆菌复合群,1株为非结核分枝杆菌;经杂交分析,34株结核分枝杆菌分离株鉴定为结核分枝杆菌复合群,1株鉴定为偶发分枝杆菌,分别与相应的特异探针杂交,2株与分析探针杂交阴性。结论16SrDNAPCR一反向斑点杂交技术可用于陕速鉴定脊柱结核分枝杆菌菌种。     

结核分枝杆菌耐利福平药物机理的初步研究

目的通过诱导试验观察结核菌产生耐利福平药物的全过程,初步分析结核菌耐该药的机理。方法采用诱导试验、聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析,对经不同药物浓度传代培养后的结核菌强毒株（H₃₇Rv）和36株临床耐药分离株进行分析。结果在诱导到第7代时,H₃₇Rv的PCR-SSCP电泳出现异常,经测序证实在513位点发生基因突变。36株临床耐药分离株中有23株发生突变,为63.9% (23/36);其中有5株与诱导株基因突变位点相同。结论用药物不间断的刺激结核菌,是产生结核菌耐利福平药物的重要原因。     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

聚合酶链反应－单链构象多态性用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系。方法以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法分析了４０株结核分支杆菌临床分离株。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法由ＰＣＲ扩增和扩增产物ＤＮＡ单链多态性分析组成。结果两对引物ＰＣＲ扩增产物分别为４１１和２５８ｂｐ，其敏感性分别为５ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ和１ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ；均为属特异性。４０株结核分支杆菌临床分离株２５８ｂｐ扩增片段ＳＳＣＰ图谱的特点：以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，１０株敏感株均无区别；单耐ＲＦＰ或包括ＲＦＰ多种抗结核药３０株，除３株外，其余２７株ＳＳＣＰ图谱有明显的区别；检测阳性率为９０％，特异性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可检测出耐ＲＦＰ结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变；该基因是ＲＦＰ的药物靶编码基因，它的突变与ＲＦＰ耐药性有密切关系，这有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究     

PCR-SSOP并Southern杂交检测实验室筛选耐氧氟沙星结核分枝杆菌的研究

目的 探讨PCR-SSCP并Southern杂交检测耐氧氟沙星(OFLX)结核分枝杆菌的可行性，并探索结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药的界限。方法 ①体外诱导筛选耐OFLX的自然突变株，并检测OFLX对这些耐药株的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)；②扩增结核分枝杆菌的gyrA基因(包括H37Rv、H37Ra、临床分离的OFLX敏感株及体外诱导筛选的耐OFLX的菌株)并对此扩增产物进行单链构象多态性(SSCP)分析及Southern杂交，以判定应用该技术的效果。结果经PCR-SSCP及Southern杂交检测，85株体外诱导的自然耐OFLX菌株，均检测到gyrA基因突变。研究发现．在OFLX 10μg／ml这一点上，明显地存在着一个耐OFLX结核分枝杆菌对OFLX敏感与耐药并存的交叉区。结论PCR-SSCP合并Southern杂交可清晰地区分OFLN敏感与耐药株。本研究结果显示，以10μg／ml为界作，为判别耐OFLX的标准是适宜的。     

耐链霉素结核分枝杆菌rpsL基因突变的研究

结核分枝杆菌的耐药性问题人们长期关注的焦点问题。对耐药性机制的研究将加深药物与结核杆菌相互作用机理的认识，有助于开发新药，发展简便、快速的检测方法，为结核病的化疗方案、病情监测及耐药性流行病学调查提供帮助。然而，常规耐药性测定需时太久，不能满足临床需要，因此探索新的快速、灵敏的耐药性测定方法迫在眉急。近来报导聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)用于耐SM基因(rpsL)突变的检测具有较多的优越性，为此我们也在这方面进行了探索。现将结果报道如下。     

DNA芯片技术检测结核分枝杆菌耐药基因

目的应用DNA芯片杂交技术快速检测临床分离株中结核分枝杆菌对异烟肼（INH）、利福平（RIF）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）的耐药性,并评价其临床应用价值。方法采用DNA芯片技术,将固定于硝酸纤维素膜上的四种药物常见耐药基因的特异性探针,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应产物进行杂交,共对97株临床分离株进行检测,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较。结果INH、RIF、SM和EMB的耐药基因检出的灵敏度分别为89．6％、98．6％、81．8％和88．2％,特异度分别为93．3％、100％、100％和100％。结论简便快速敏感的DNA芯片杂交方法适用于临床批量结核分枝杆菌耐药性的初筛。     

用变性高压液相色谱技术检测耐氧氟沙星的结核分枝杆菌临床株

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌gyrA基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物做出初步判断。方法提取试验菌株基因组DNA，扩增gyrA基因的氟喹诺酮药物耐受决定区（QRDR）核酸片段；分别与H37Rv标准株（或者含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准）的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。采用2mg/L的药物浓度进行氧氟沙星（OFLX）药物敏感性试验，确定101株结核分枝杆菌临床分离株对OFLX的敏感性，通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果，建立两者之间的对应关系。结果利用DHPLC检测QRDR突变与序列测定具有同样的检出率（100％），两者都能够很好地检测QRDR突变。采用单纯含有Ser284突变的临床分离株代替H37Rv作为标准进行DHPLC检测，可以检测出除Ser284突变点外所有的点突变形式。在101株结核分枝杆菌临床分离株中，有49株对2mg／L OFLX敏感；52株耐受。52株耐药菌株中，有27株能够通过序列测定和DHPLC法得到准确判定。采用含有单纯Ser284突变的临床分离株作为标准进行DHPLC检测菌株的耐药性，检测结果更准确。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌gyrA基因碱基突变的好方法，但是碱基突变与结核分枝杆菌是否耐受氟喹诺酮类药物存复杂的关系，因此该方法应用于临床检测尚需进一步验证。     

耐氧氟沙星结核分枝杆菌对五种氟喹诺酮类药物交叉耐药的研究

目的 研究耐氧氟沙星结核分枝杆菌对5种不同氟喹诺酮类药物之间的交叉耐药性.方法 本研究选取来自于2007年全国结核病耐药性基线调查的130株对氧氟沙星耐药的结核分枝杆菌菌株,用微孔板稀释法检测这些菌株对5种氟喹诺酮类药物（氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星以及司帕沙星）的最低抑菌浓度,统计耐药率的差别并分析对某种氟喹诺酮类药物耐药的菌株中对其他4种药物的耐药率的差别,组间差异的比较采用卡方检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 130株对氧氟沙星耐药的菌株中,分别有110株（84.6％,110/130）、108株（83.1％,108/130）、46株（35.4％,46/130）及66株（50.8％,66/130）对左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星及司帕沙星耐药.加替沙星耐药率显著低于左氧氟沙星（x2=65.641,P＜0.01）、莫西沙星（x2=61.225,P＜0.01）和司帕沙星（x2=6.274,P=0.02）的耐药率.左氧氟沙星耐药菌株中分别有90.9％（100/110）、41.8％（46/110）和59.1％（65/110）的菌株对莫西沙星、加替沙星和司帕沙星耐药;在加替沙星和司帕沙星耐药菌株中,有97.8％（45/46）和97.0％（64/66）对莫西沙星耐药.莫西沙星耐药株中分别有41.7％（45/108）和59.3％（64/108）对加替沙星和司帕沙星耐药.结论 上述5种氟喹诺酮类药物之间呈现出不同的交叉耐药性,其中左氧氟沙星和莫西沙星交叉耐药,加替沙星和司帕沙星与莫西沙星之间表现为部分单向交叉耐药.     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的　应用PCRSSCP技术快速检测耐INH,RFP,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及25株结核分支杆菌敏感分离株用PCRSSCP方法分别检测,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中,rpoB、KatG、rpsL PCR扩增产物PCR-SSCP分别有28株(87.5%)rpoB基因,19株(59.3%)KatG基因和23株(71.9%)rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H₃₇Rv电泳条带相比有明显差异,而25株结核分支杆菌敏感株的PCR-SSCP条带与结核分支杆菌H₃₇Rv相似,特异性为100%。结论 PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变,有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

体外诱导对氨基水杨酸高浓度耐药结核分枝杆菌及其突变位点研究

目的:通过对实验室诱导产生的对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid, PAS)耐药结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)和临床分离株进行全基因组测序,探索PAS的潜在作用机制和耐药性。方法:通过体外药物浓度梯度诱导法,将MTB标准菌株H37Rv诱导成标准耐PAS菌株及高水平耐药菌株,收集并保存每一代诱导菌株。用液体微孔板法检测上述诱导菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)及交叉耐药情况,筛选耐药水平相似的临床分离株。通过对PAS耐药的实验室突变株和临床分离株进行全基因组测序,从基因水平上探索MTB对PAS的耐药机制。结果:本研究在体外建立了耐PAS的MTB耐药动态变化模型。全基因组测序结果显示,PAS耐药可能与3个位点突变直接相关,分别是plcC(Q462R)、folC(S150R)和1个thyA上游位点(3074495G→A)。MTB对高水平的PAS耐药的产生除了基因突变因素以外,尚存在其他的调控机制。对PAS敏感和耐药的MTB临床分离株测序发现某些folC、thy...     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

结核分枝杆菌thyA基因突变与对氨基水杨酸钠耐药关系的研究

目的 了解Mtb临床分离菌株中对于对氨基水杨酸钠（PAS）的耐药率及PAS耐药性与thyA基因突变的关系。 方法 从肺结核患者的痰标本中分离并鉴定Mtb 96株,采用比例法、全基因测序的方法检测上述Mtb临床菌株对PAS的耐药性情况及其thyA基因突变情况。结果 96株Mtb中,65株为PAS敏感菌株和31株为PAS耐药菌株。以Mtb标准菌株H37Rv为对照,筛选敏感和耐药菌株中的thyA基因突变率分别是46.15%（30/65）、70.97%（22/31）,突变多为单个碱基的缺失和插入突变,其中又以第19位密码子缺失C、第168位密码子缺失C为主,在耐药中所占比率分别是54.84%（17/31）、25.81%（8/31）,其在敏感菌株中的比率也分别是35.38%（23/65）、12.31%（8/65）。结论 耐药菌株中thyA基因的突变频率明显高于敏感菌株,thyA基因可能是PAS耐药潜在靶点,但未发现其特异性突变位点。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变微通道电泳检测方法的建立

目的 建立一种用微通道电泳芯片分析系统检测结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变的方法。方法 以丙烯酰胺及其衍生物的聚合物溶液作为筛分介质，溶液中掺入微量的吖啶橙作为荧光标记物，对结核分支杆菌的异烟肼耐药相关的katG和inhA基因进行单链构象多态性(SSCP)分析，检测其与耐药性相关的突变。对于突变部位附近没有二级结构的inhA基因，设计了特别的引物使扩增产物增加一个能与突变部位配对的区域，从而使野生型片段呈现独特的构象。结果 此方法可实现对katG基因野生型片段与315位密码子突变型片段的区分，以及对inhA基因调节序列野生型与突变型片段的区分。30个临床分离株中的23个耐药株有22个被检出，效率达95％。结论 微通道电泳方法用于结核杆菌耐药基因突变检测，具有快速、灵敏的优点，可望将之应用于临床耐药性检测。     

应用反向斑点杂交法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。