结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c假想蛋白间的相互作用

目的 观察结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c假想蛋白间的相互作用.方法 采用PCR技术克隆结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c假想蛋白基因, 构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-Rv1247c和pGADT7-Rv1246c, 经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后, 采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109,检测β半乳糖苷酶活性.结果 共转染GBKT7-Rv1247c和pGADT7-Rv1246c的酵母菌AH109可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷培养基上生长,β半乳糖苷酶活性实验阳性.结论 利用酵母双杂交系统证实结核分枝杆菌Rv1246c与Rv1247c假想蛋白可以相互作用.     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用

目的在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A蛋白(RipA),纯化后观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用。方法采用PCR方法 ,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA。以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,观察RipA蛋白的促生长作用。结果成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆,经诱导,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为52×103的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6×HisAb有特异性的反应条带。采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白。100pM的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长。结论 RipA蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长,为MTB的快速诊断研究奠定了基础。     

Rv1272和Rv1273与结核分枝杆菌耐药相关性研究

目的研究结核分枝杆菌Rv1272和Rv1273基因编码蛋白与药物外排的关系。方法利用生物信息学方法分析Rv1272和Rv1273基因及其编码蛋白的结构,采用PCR技术扩增该两个基因,并与pMF406质粒连接构建重组质粒,测序正确后,电穿孔法将重组质粒转化耻垢分枝杆菌m c2155。采用W estern b lotting对两个目的蛋白进行亚细胞定位;试管法测定重组菌株对常用的9种抗菌药物的最低抑菌浓度(M IC),以转化pMF406空质粒的耻垢分枝杆菌作为对照菌株。结果经测序验证重组质粒构建成功,W estern b lotting结果显示Rv1272和Rv1273为膜蛋白。试管法测定结果显示:含有目的基因的重组菌株对9种抗菌药物的M IC与对照菌株比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Rv1272和Rv1273蛋白为膜蛋白,未发现其与结核菌耐药之间的直接关系。     

小鼠巨噬细胞转染Rv0901基因后活性的改变

目的 将重组结核分枝杆菌Rv0901基因的重组质粒pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠腹腔巨噬细胞,研究结核分枝杆菌Rv0901基因在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中所起的作用.方法 制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rv0901质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA混合,以脂质体转染的方式共转染小鼠腹腔巨噬细胞.转染后72 h,分别收集细胞用流式细胞仪检测GFP的表达和细胞凋亡的发生情况,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测质粒的转染情况.收集转染72 h后的细胞培养液上清,检测细胞NO、IFN-γ的释放水平.结果 pcDNA3.1和pcDNA3.1-Rv0901转染的巨噬细胞中均检测到了GFP的表达,转染后的巨噬细胞RT-PCR能扩增出Rv0901的目的 片段,pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞的凋亡率高于空载体对照组[(56.4±2.0)% vs (19.9±1.5)%,P＜0.05], pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞培养液上清中NO和IFN-γ的释放量高于空载体对照组[NO:(40.4±3.0) μmol/L vs (27.5±3.2) μmol/L, IFN-γ:(2.11±0.031) ng/mL vs (0.62±0.025) ng/mL,P均＜0.05].结论 pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠巨噬细胞后使巨噬细胞的凋亡增加,NO和IFN-γ的释放量增加,提示结核分枝杆菌Rv0901基因可能导致巨噬细胞的活性增强,与结核分枝杆菌感染巨噬细胞的机理有关.     

乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌的杀灭作用研究

目的 研究消毒剂乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠(levulinic acid,sodium dodecyl sulfate,LVA-SDS)对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭作用.方法 按照2002年版卫生部《消毒技术规范》要求,同时参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) M07-A9的试验方法,在96微孔板上采用微量培养法和悬液定量杀菌试验,分别检测LVA-SDS的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)以及不同浓度的LVA-SDS对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭作用.结果 LVA对大肠埃希菌作用后的MIC值、MBC值均为0.3％LVA,对耻垢分枝杆菌作用后均为0.6％LVA,对结核分枝杆菌标准株H37Rv作用后均为0.075％LVA.LVA-SDS对大肠埃希菌作用后的MIC值、MBC值均为0.3％LVA+0.03％ SDS,而对耻垢分枝杆菌作用后均为0.6％LVA+0.06％SDS,对结核分枝杆菌标准株H37Rv作用后均为0.075％LVA+0.0075％ SDS.一定浓度范围的LVA-SDS随着时间(1～10 min)的延长,对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌的杀灭作用逐渐增强.5％LVA+0.5％SDS作用3 min对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌的杀灭率均达到100％.结论 LVA-SDS对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株H37Rv均有较好的杀灭作用,具有较强的实际应用前景.     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立

目的建立表达人IL-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治膀胱癌打下基础.方法分别从中间质粒pY6013和pIJK-1中克隆出分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)启动子和堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽,再从质粒pHIG53中利用PCR扩增出不含信号肽的IL-2cDNA,利用分枝杆菌质粒pRR3构建IL-2分枝杆菌穿梭表达载体并使IL-2在其中分泌表达.将重组质粒电转化到耻垢分枝杆菌中建立重组耻垢分枝杆菌疫苗株.连续传代培养观察重组菌株的稳定性.Western blot和IL-2活性测定等方法观察IL-2的表达及其活性.结果经测序表明HSP70、α抗原信号肽及IL-2的序列及读码框架均正确.Western blot及IL-2活性检测表明在重组耻垢分枝杆菌上清中有IL-2表达,其生物活性为118.5 U/ml(细菌浓度为5×105CFU/ml,其培养时间为36 h).结论成功建立了分泌人IL-2的重组耻垢分枝杆菌,为进一步防治膀胱肿瘤的复发奠定了基础.     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

结核分枝杆菌fbpB基因植物表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌fbpB基因的植物表达载体,为在植物中表达该基因奠定基础。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增fbpB编码基因,然后将其克隆到植物表达载体pBI121上,并进行鉴定。结果:重组载体经菌液PCR鉴定为阳性克隆后再经双酶切鉴定可见约13kb和1kb的2条特异性条带,与预期大小相一致,测序结果表明克隆的fbpB基因序列与Genbank上公布的相一致。结论:成功构建了fbpB基因的植物表达载体,为研制和开发新型的结核疫苗打下坚实的基础。     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定结核分枝杆菌重组双歧杆菌（（Bifidobacteria bifidum,Bb）-ESAT-6-MPT64疫苗。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增ESAT-6和MPT64单基因序列,然后采用基因拼接（gene SOEing）法构建融合基因ESAT-6-MPT64,定向克隆至穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;再电转化入Bb,构建结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗。结果 PCR成功扩增出1020bp的ESAT-6-MPT64融合基因;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。结论成功构建了结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗,为进一步研究其免疫保护效果奠定了基础。     

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株，为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段，克隆入pET32a（＋），鉴定无误后，再亚克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pLA71，构建pLA71-omp载体，将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌，经卡那霉素筛选后，抽提质粒用PCR法鉴定，Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性，Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli／MS间进行穿梭，并在耻垢分枝杆菌中表达。     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。