华支睾吸虫成虫CsRPEF基因的生物信息学分析

目的筛选华支睾吸虫的功能基因并进行相应的生物信息学分析。方法使用PCGENE软件、Antheprot-5软件、ExPASy在线分析工具、NCBI上的Blastx程序进行华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(CsRPEF)基因的生物信息学分析。结果获得了CsRPEF基因的序列特征,推测到了CsRPEF的同源蛋白并预测出CsRPEF编码蛋白的分子量、等电点、柔曲性、疏水性、功能性位点等二级结构特征。结论华支睾吸虫成虫CsRPEF基因是一新筛选的功能基因,CsRPEF蛋白是可能参与华支睾吸虫基因转录途径的重要因子。CsRPEF基因的生物信息学分析可为其进一步进行生物学功能的实验研究奠定基础。     

华支睾吸虫乙醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

[目的]通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1并表达出融合蛋白.[方法]用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒测序,结果在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Dom ain Search等程序对其进行开放阅读框(ORF)、进化树及结构域分析.根据载体多克隆位点及新基因ORF设计引物,PCR扩增,产物克隆到目的载体上.筛选并鉴定出阳性克隆,对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定.[结果]发现CsALDH基因,完整阅读框含1467个碱基,编码489个氨基酸,理论相对分子质量Mr≈52.564×103,理论pI为5.43.序列分析表明,CsALDH基因编码的氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CsALDH与爪蛙属乙醛脱氢酶的同源性为59%,具有乙醛脱氢酶保守功能域.构建的重组原核表达质粒经鉴定与目标基因相符.电泳显示表达产物在Mr≈78×103处有一条特异性条带.[结论]发现华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白.     

华支睾吸虫RPEF基因的克隆与序列分析

目的:构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因PET重组质粒，分析其编码序列。方法:根据RPEF基因已知序列设计一对引物，用PCR技术从华支睾吸虫质粒库模板中扩增RPEF基因片段；将目的基因PCR产物和空质粒PET30a( )同时用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶双酶切，纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21。将构建的重组质粒PET30a( )-RPEF经双酶切、PCR、测序鉴定后证明获得正确的重组克隆。结果：成功构建出RPEF基因原核重组质粒PET30a( )-RPEF。序列分析表明，RPEF蛋白与鼠类RNA polymerase Ⅱ延长因子具有很高的同源性。结论：RPEF基因在华支睾吸虫基因表达调控机制中可能起重要作用。RPEF基因重组表达载体PET．30a( )-RPEF的成功构建可为更深入地分析其基因功能、肝吸虫病药物靶标的筛选奠定基础。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中识别组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,为进一步的实验研究提供理论指导。方法利用生物信息学网站的在线分析工具和Vector NTI suite软件包,识别华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因,并预测其编码蛋白质的各种结构特征与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果BLASTx分析该基因为全长基因,该基因全长1,459bp,编码425个氨基酸,具有两个天冬氨酸蛋白酶的催化位点。SignalP分析该基因编码的蛋白质含有信号肽序列,切割位点在第17和第18个氨基酸之间,分子进化树提示其与日本血吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶亲缘关系最近。结论组织蛋白酶D属于天冬氨酸蛋白酶家族,为分泌性蛋白,与日本血吸虫同源基因一致性最高,为后续实验筛选华支睾吸虫病的诊断抗原及药物靶标提供了必要的理论依据。     

抗华支睾吸虫抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

为了制备抗华支睾吸虫基因工程抗体,本文从感染华支睾吸虫患者的淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR,扩增出约700bp的重链Fd段和轻链κ、λ基因,经Xho　I和Spe　I,SacI和 Xba　I双酶切后,分别和质粒载体pComb3连接,再经电穿孔转化大肠杆菌XL 1-blue菌株,将轻链和重链Fd基因先后克隆人pComb3中,成功地构建了抗华支睾吸虫Fab段抗体基因的表达载体,为进一步构建噬菌体抗体库奠定基础。     

华支睾吸虫SPE16.9基因克隆和序列分析

目的 通过筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因,为进一步研究其功能及其应用奠定基础。方法 对华支睾吸虫cDNA文库进行筛选,通过Blastn程序进行序列比对,识别华支睾吸虫新基因,并应用软件程序对其进行分析。结果 筛选到一个475bp的核酸序列,编码153aa,理论分子量为16．9kDa,理论等电点（pI）为6．19,疏水氨基酸（AILFWV）占36％,带电荷氨基酸（RKHYCDE）占30％,极性氨基酸（NCQSTY）占28％．酸性氨基酸（DE）和碱性氨基酸（KR）各占9％。经BLAST分析,该蛋白属于ML域（MD-2-related lipid-reeognition）家族．是一个新的分泌蛋白基因。结论 发现华支睾吸虫分泌蛋白基因,可能有作为诊断候选抗原的价值。     

华支睾吸虫ATP合酶B亚基全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别ATP合酶B亚基,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,用以指导实验研究。方法利用生物信息学网站的各种在线分析工具和Vector NT Isuite软件包,识别华支睾吸虫ATP合酶B亚基基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果Blastx分析该基因为全长基因,属于ATP合酶B亚基家族,其分子进化树与种系进化过程非常吻合。该基因全长1008bp,编码300个氨基酸,含有线粒体转运肽、两个跨膜区、一个核定位序列和多个磷酸化位点,具有较稳定的理化性质。结论ATP合酶B亚基是一个理想的真核种系进化的分子标志。华支睾吸虫ATP合酶B亚基具有线粒体和细胞核的双重定位序列,提示该蛋白可能在华支睾吸虫的能量代谢途径中发挥独特的调节作用。     

华支睾吸虫的扫描电镜观察

本文应用扫描电镜对华支睾吸虫体表微细结构、感觉器的类型和分布等进行了观察。其中发现腹吸盘腔的底部有互相连接比较粗大的枝状物以及具纤毛的环状乳突和无纤毛的扁平乳突,这些都是过去文献未见报道过的。     

华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)基因的识别及其结构与功能分析

目的分析华支睾吸虫乳酸脱氢酶基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法利用多种生物信息在线分析工具和分析软件包,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库的表达序列标签(EST)中识别乳酸脱氢酶(CsLDH)基因,预测该基因编码蛋白质的理化特性、氨基酸修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维结构及酶学特性和免疫学特性等。结果该基因全长1224bp,编码区为79～1062,编码328aa,理论分子量为35633Mr,等电点为8.13,半衰期长,理化性质稳定,含有多个潜在的磷酸化和酯酰化位点。预测该蛋白有3个跨膜区,其拓扑结构为N端在膜内侧、C端在膜外侧。有两个主要的线性抗原表位aa10～aa20和aa94～aa102,后者位于膜外,与日本血吸虫LDH相应表位完全一致,与人和小鼠LDH相应表位仅有1个氨基酸差异。该表位中Arg102是酶催化中心的关键氨基酸之一,模拟三维结构显示组成催化中心的另外两个关键氨基酸残基Asp162和His189的空间位置也靠近该表位,酶的催化中心贯穿膜内外。结论推测华支睾吸虫乳酸脱氢酶不仅负责将糖酵解产生的丙酮酸转化为乳酸,而且还能将乳酸直接排出体外;可作为筛选水溶性抗华支睾吸虫药物的靶标;可介导特异性抗体对虫体的ADCC作用和补体的杀伤作用,以及对酶活性的抑制作用,是一个重要的疫苗侯选抗原。     

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的　构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。　方法　提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。　结果　未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。　结论　已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD NA表达文库     

华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

目的 构建华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。方法提取华支睾吸虫囊蚴总RNA;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒并按其操作方法进行,进行反转录合成双链cDNA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用ChromaSpin 400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收0.4～4kb的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌斑,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 未扩增文库滴度达7.0×107pfu/ml,扩增文库滴度达2.5×108pfu/ml;用载体两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:扩增文库中,含1kb以上的占30％左右,1kb～500bp占69％。结论已成功地获得一高质量的华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库。     

一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白(CsMLP)进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-CsMLP重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论 CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性,其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。     

武鸣县华支睾吸虫病流行情况调查

目的了解武鸣县华支睾吸虫病流行情况。方法根据行政区划,随机选取调查点,用醛醚集卵法粪检华支睾吸虫卵,用压片法检查螺、鱼类的自然感染情况,通过解剖动物查找成虫并了解保虫宿主的感染情况。结果共粪检35698人,阳性人数10036人,人群平均感染率为28.11%;成人平均感染率为34.89%,中小学生平均感染率22.41%,男性平均感染率为31.10%,女性平均感染率为23.32%;中间宿主螺类平均自然感染率0.91%,鱼类8.81%,保虫宿主家犬感染率16.67%,猫40.00%。结论县境内华支睾吸虫病广泛流行,属重度流行区;流行区呈“片状”分布,以县城、乡镇、村圩等集市为中心,感染率逐渐向边远地区下降。     

两个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因克隆、表达与定性

目的寻找对华支睾吸虫病诊断有效的抗原基因,以便生物合成并研究其应用价值.方法选取两个Genbank已报告的基因序列AF271091(CysA)及AF093242(CysB)分别克隆与表达融合蛋白,亲和层析纯化后进行免疫定性.结果CysA与CysB均获得成功克隆与表达,Western blot分析显示CysA与华支睾吸虫病阳性血清有强反应,与日本血吸虫病阳性血清只有很弱的交叉反应,而CysA与华支睾吸虫感染血清无反应.免疫组化显示,被表达的两个半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫体内的免疫定位无显著不同,主要在成虫肠道及虫卵.结论成功表达的两个半胱氨酸蛋白酶中,CysB针对华支睾吸虫病血清有良好的抗原活性,值得视为诊断抗原候选做进一步的研究.     

我院就诊人群华支睾吸虫感染的临床分析

目的掌握华支睾吸虫感染和患病情况的临床特点,探讨临床简便的确诊方法,指导相应的防治对策。方法对我院2007-2009年随机就诊的广东人群进行大便常规检查,并对发现华支睾吸虫卵的患者的临床资料进行统计分析。结果 56140例受检患者发现,华支睾吸虫感染1029例(1.83%)。主要临床症状为肝区疼痛486例(47.2%)、上腹疼痛297例(28.9%)、腹泻173例(16.8%)、乏力147例(14.3%)、食欲不振107例(10.4%),主要疾病有胆囊炎462例(44.9%)、胆囊息肉213例(20.7%)、胆管壁增厚182例(17.7%)、胆石症132例(12.8%)。实验室辅助检查中,华支睾吸虫感染组的嗜酸性粒细胞比例(EOS%)及血清γ谷氨酰转肽酶活性(GGT)显著高于非感染患者组(Z=-10.837,P<0.01;Z=-6.622,P<0.01)和健康对照组(Z=-7.320,P<0.01;Z=-6.920,P<0.01)。丙氨酸氨基转移酶活性(ALT)在华支睾吸虫感染有症状组中显著高于非感染患者组(Z=-3.528,P<0.01)和健康对照组(Z=-4.948,P<0.01),而在华支睾吸虫感染无症状组中与非感染患者组和健康对照组无显著性差异(Z=-1.561,P=0.119;Z=-1.834,P=0.067)。结论肝区疼痛和上腹不适是华支睾吸虫病的主要临床表现,在EOS%和GGT增高的患者中华支睾吸虫卵的检出率明显提高。     

2007～2009年广州部分人群肝吸虫病感染状况血清学分析

目的了解广州地区人群肝吸虫感染状况。方法应用ELISA法检测健康体检人群的肝吸虫抗体。结果三年共检测14 600例,其中肝吸虫抗体阳性1 669例,阳性率为11.4%,并呈逐年上升趋势。其中男性阳性率为13.0%（1 242/9 530）,女性8.4%（427/5 070）,男女之间差异有统计学意义（P=0.000）。结论广州地区人群中肝吸虫感染率逐年升高,且男性感染率显著高于女性,应加强健康人群肝吸虫病的监测,开展卫生教育,防止经口感染,以有效控制正常人群肝吸虫的感染。