RNA干扰PTTG基因对泌乳素型垂体瘤细胞凋亡的机制研究

目的 研究RNA干扰垂体瘤转化基因(PTTG)对泌乳素型垂体瘤细胞(HPA)凋亡的影响并探讨其作用机制.方法 设计并合成靶定PTTG的特异性siRNA片段,转入体外培养HPA细胞,48h后验证siRNA的干扰效应;Annexin V/PI染色法观察PTTG基因沉默对细胞凋亡的影响;RT-PCR和Western blot检测caspase-3在mRNA和蛋白水平表达;caspase活性检测试剂盒检测caspase活性.结果 设计合成的PTTGsiKNA转染后,能够有效抑制体外培养HPA细胞内PTTG表达实现其基因沉默效应;经浓度梯度CDDP诱导24h,转染和未转染细胞均产生细胞凋亡,caspase-3表达增强,并呈现出浓度依赖性;RNA干扰组细胞凋亡率低于未转染组,转染组caspase-3活化受抑,其caspase-3基因表达、蛋白活性均低于未转染组(P<0.05).结论 PTTG在人泌乳素型垂体瘤中过表达,能通过激活caspase-3促进HPA细胞凋亡,可作为该肿瘤临床诊断和基因治疗的新靶点.     

RNAi抑制食管癌EC109细胞株叶酸受体αmRNA表达的实验研究*

目的 利用RNAi技术特异性抑制食管癌EC109细胞株叶酸受体（folate receptorα,FRα）mRNA表达,研究其对EC109细胞株体外增殖能力的影响。方法 化学合成针对FRα基因三个不同靶点的三条FRαsiRNA（FRαsiRNA1,FRαsiRNA2和FRαsiRNA3）,分别转染EC109细胞株,以未转染细胞为正常对照,转染阴性siRNA的细胞为阴性对照。免疫印迹法检测FRα蛋白表达,CCK8法检测RNA干扰后24 ,48 ,72 ,96h细胞增殖,流式细胞仪检测RNA干扰后24 ,48 ,72 ,96h细胞凋亡。 结果 免疫印迹法提示FRαsiRNA1组FRα表达为正常对照组的14.7%;FRαsiRNA2组FRα表达为正常对照组的55.1%;FRαsiRNA3组FRα表达为正常对照组的62.9%;干扰后细胞增殖情况：干扰后24 ,48 ,72 ,96h细胞存活率均降低,分别为（81.15±1.97）%、（68.18±3.45）%、（49.82±7.64）%、（32.92±2.61）%。干扰后96h细胞存活率最低,与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.001）;干扰后细胞凋亡情况 24 ,48 ,72 ,96h后干扰组凋亡分别为（3.95±0.45）%、（6.23±1.11）%、（10.00±0.30）%、（3.07±0.40）%,干扰后72h凋亡率最高,与正常对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.001）。 结论 成功转染并抑制了FRα在食管癌细胞株EC109中的表达,干扰后细胞增殖受抑制,凋亡增加。     

RNA靶向干扰DcR3促进人肝癌HepG2细胞凋亡及机制研究

目的研究靶向干扰DcR3基因对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法设计并合成DcR3基因的特异性DcR3 siRNA(实验组)和非特异性DcR3 siRNA(对照组),在脂质体介导下分别转染HepG2细胞株。Western blot检测两组DcR3 siRNA转染HepG2细胞24和48 h后DcR3蛋白表达水平;MTT法检测转染48 h细胞生长增殖;流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳检测转染24 h细胞凋亡;免疫组化法检测转染24 h细胞caspase3蛋白的表达。结果实验组细胞24和48 h DcR3蛋白相对表达水平分别为(0.532±0.051)和(0.417±0.044);对照组分别为(1.978±0.246)和(2.018±0.275);两组比较,相同时间点相对表达水平差异有显著性(P0.05);实验组24和48 h DcR3蛋白相对表达水平比较差异有显著性(P0.05),对照组差异无显著性(P0.05)。两组细胞转染48 h抑制率分别为(59.8±5.4)%和(0.8±0.1)%,两者比较差异有显著性(P0.05);两组细胞转染24 h凋亡率分别为(19.7±3.2)%和(6.9±0.8)%,两者比较差异有显著性(P0.05);转染24 h后两组caspase3蛋白阳性率分别为72.8%和38.9%,平均光密度值分别为(0.41±0.06)和(0.21±0.03),两者比较差异有显著性(P0.05)。结论特异性DcR3 siRNA有抑制人肝癌HepG2细胞DcR3蛋白表达、细胞增殖和诱导凋亡的作用,其机制可能与上调caspase 3的表达有关。     

RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase-3酶活性的影响

目的观察RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase－3酶活性的影响。方法针对survivinmRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建shRNA重组质粒,转染Hela细胞,筛选获得转染效率最高的阳性克隆,阴性对照为阳性克隆随机打乱序列。Westernblot方法检测survivin蛋白表达,分光光度法检测caspase－3酶活性。结果干扰48h时,siRNA－168载体干预组干预效果最好,siRNA阳性质粒干扰组（实验组）survivin蛋白表达量为阴性对照组中survivin蛋白表达量的13％,是空白组survivin蛋白表达量的16％。干扰后caspase－3活性表达升高,实验组与阴性对照组、实验组与空白组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA可有效抑制Hela细胞survivin蛋白表达。升高caspase－3酶活性。     

靶向mTOR siRNA的合成及对MCF-7细胞mTOR基因表达的影响

目的:合成靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)siRNA,观察其对人乳癌MCF-7细胞mTOR基因表达的影响。方法:以mTOR基因434～452序列为靶点,设计并体外合成mTORsiRNA,用100和150nmol/L的siRNA转染MCF-7细胞24、48、72h,同时设无关对照组(转染非特异性siRNA)和正常对照组(不转染),运用免疫组化SP法和原位杂交技术检测各组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达水平。结果:转染24、48和72h后,与各对照组相比,siRNA转染组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达均降低(P均<0.05),2个siRNA转染组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。不同时间点mTOR蛋白及mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:设计合成的siRNA可有效抑制乳癌MCF-7细胞mTOR基因的表达。     

靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的 采用RNA干扰技术阻断STAT5基因的表达,观察其对人肝癌SMMC-7721凋亡的影响.方法 构建3种靶向STAT5的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,采用LipofectamineTM2000转染肝癌细胞SMMC-7721;分别采用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染前后SMMC-7721细胞STAT5 mRNA和蛋白质表达的变化;采用透射电镜技术观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 3条靶向STATS的序列特异性的siRNA可以有效地抑制SMMC-7721细胞STATS mRNA和蛋白质表达,STAT5 mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,STAT5蛋白表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%;转染靶向STAT5的siRNA真核表达载体48 h后出现凋亡细胞的典型形态学变化,并诱导25.61%的SMMC-7721细胞发生凋亡.结论 靶向STAT5的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断SMMC-7721细胞STAT5基因的表达,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,STAT5 siRNA在人肝癌的基因治疗中可能具有潜在的应用价值.     

靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达 对HepG2 肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG2 肝癌细胞体外增殖与凋亡的影响。 方法 利用基因重组技术构建PDCD5-Caspase-3 融合基因,克隆到带有EGFP 基因的GV358 慢病毒表达载 体,与辅助质粒共同转染293T 细胞,通过同源重组,获得融合基因重组慢病毒PDCD5-Caspase-3。体外 转染人肝癌HepG-2 细胞72 h 后,Western bolt 检测肝癌HepG-2 细胞中PDCD5 蛋白和Caspase-3 蛋白表 达,CCK-8 法检测PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG-2 肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术观察其 对细胞凋亡的影响。结果 PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达可增加HepG-2 肝癌细胞中PDCD5 蛋白和 Caspase-3 蛋白合成（P <0.05）;与对照组或空白组相比,转染72 h 后实验组细胞增殖能力下降（P <0.05）; 与对照组或空白组比较,转染72 h 后实验组细胞凋亡率增加（P <0.05）。结论 促凋亡基因PDCD5 和 Caspase-3 联合表达可抑制HepG2 肝癌细胞增殖,并促进其凋亡,可作为肝癌治疗潜在靶点。     

长链非编码RNA PVT1沉默对K562细胞增殖的影响

目的 筛选靶向抑制长链非编码RNA(lncRNA)浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)的小干扰RNA(siRNA),并探讨其对人白血病细胞株K562细胞增殖的影响.方法 针对PVT1设计合成PVT1-siRNA1、2、3、4序列及无关对照siRNA(SC-siRNA)序列.利用HiperFect转染试剂将各条siRNA转入K562细胞,实验依此分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组和SC-siRNA组,并设空转组和细胞组.转染后用实时定量RT-PCR检测细胞中PVT1 RNA的相对表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期.结果 转染24、48 h后siRNA4组PVT1 RNA水平下降,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01), 而siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组PVT1 RNA水平与细胞组相比差异无统计学意义(P>0.05);转染24、48、72 h后siRNA4组细胞增殖抑制率都增加,与SC-siRNA组和空转组相比差异均有统计学意义(P<0.01);转染48、72 h后siRNA4组出现了G1期阻滞,G1期细胞比例增加,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 PVT1-siRNA可通过阻滞细胞周期的进展而抑制K562细胞的增殖.     

泛素特异性蛋白酶18在肝癌细胞中的表达及其对生物学活性的影响研究

目的 检测泛素特异性蛋白酶18（USP18）在肝癌细胞中的表达及其对生物学活性（细胞增殖、细胞克隆、细胞周期、细胞凋亡）的影响。方法 2013年7月—2014年7月选取5种肝癌细胞株（Hep G2、Hep G2.2.15、Hep 3B、Huh-7、SMMC-7721）,采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blotting法分别检测USP18 mRNA和USP18表达水平,选择表达活性最强的细胞株进行小干扰RNA（siRNA）转染。利用LipofectamineTM 2000法将USP18 siRNA转染肝癌细胞,分为正常组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组。采用RT-PCR和Western blotting法检测干扰效率,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验检测克隆形成率,流式细胞术检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 5种肝癌细胞株中USP18 mRNA和USP18表达水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中Hep 3B肝癌细胞株中USP18 mRNA和USP18表达水平高于其他4种肝癌细胞株（P＜0.05）,故选取Hep 3B肝癌细胞株进行后续实验。Hep 3B肝癌细胞株转染USP18 siRNA后48 h,转染效率达（91.00±5.67）%。5组干扰效率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组干扰效率高于正常组和阴性对照组（P＜0.05）。转染后1、2、3 d,siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组吸光度低于正常组和阴性对照组（P＜0.05）。siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组克隆形成率低于正常组和阴性对照组,细胞凋亡率高于正常组和阴性对照组（P＜0.05）。5组细胞周期分布比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组与阴性对照组吸光度、克隆形成率、细胞周期分布、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 USP18在Hep 3B肝癌细胞株中的表达较高,USP18基因敲减可以抑制肝癌细胞增殖、减少细胞克隆、阻滞细胞周期进程,增加细胞凋亡。     

上调miR-125b对肝癌Huh-7细胞系增殖及顺铂诱导凋亡的作用研究

目的 研究miR-125b在肝癌发生发展中的作用机制,及其表达对于肝细胞癌化疗耐受性的影响.方法 采用qPCR检测肝癌患者癌组织、癌旁组织、Huh-7细胞系(对照组)及转染miR-125b mimic的Huh-7细胞系(转染组)中miR-125b表达情况.采用流式细胞仪及MTT法检测对照组及转染组细胞周期及增殖情况.Western blot检测Huh-7细胞系转染后Mcl-1蛋白表达.设3组:对照组为正常培养细胞,miRNAcontrol组转染miRNA control,miR-125b mimic组转染miR-125b mimic.Western blot检测Mcl-1特异性siRNA阻断Mcl-1蛋白表达后,细胞凋亡相关蛋白caspase3的表达情况.设3组:对照组细胞正常培养;顺铂组加入顺铂,终浓度50 μg/mL培养;转染+顺铂组转染Mcl-1-siRNA,48 h后加入顺铂,终浓度50 μg/mL.结果 肝癌组织miR-125b表达较癌旁组织明显减低,为癌旁组织的(46.24±8.53)％,P＜0.05.miR-125b mimic转染Huh-7细胞后,转染组细胞G1/S比例较对照组明显增高(P ＜0.05);Mcl-1蛋白表达较对照及miRNAcontrol组下调(P＜0.05);转染+顺铂组中的Caspase3蛋白表达较对照组及顺铂组明显增高(P＜0.05).结论 上调miR-125b的表达可以抑制肝癌细胞增殖,抑制靶蛋白Mcl-1表达,促进顺铂诱导凋亡,具有抑癌基因的作用.     

Mithramycin A对肝癌细胞Huh-7增殖的影响

目的研究抗肿瘤抗生素光辉霉素（Mithramycin A,MIT）对人肝癌细胞Huh-7的作用。方法CCK-8比色法观察MIT对Huh-7细胞的生长抑制作用,Hoechst 33342/PI双荧光染色分析细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果MIT可抑制Huh-7细胞的生长,半数抑制浓度（IC50）为60.12 nmol.L^-1。荧光显微镜观察可见细胞凋亡特征性改变;浓度为5×10^-2μmol.L^-1的MIT作用72 h后,可明显诱导Huh-7细胞凋亡,流式细胞仪检测肿瘤细胞出现典型亚二倍体凋亡小峰。结论MIT对Huh-7细胞有明显的诱导凋亡和生长抑制作用,具有浓度、时间依赖性。     

TGF- β 1/SMAD SIGNALING PATHWAY MEDIATES p5 3 -DEPENDENT APOPTOSIS IN HEPATOMA CELL LINES

HEPATOCELLULARcarcinoma(HCC)isoneofthemostcommonanddevastatingmalignanttumors,withanestimatedannualincidenceofonemillioncases,mainlyinAfricanandAsianregions.Inrecentyears,importantadvanceshavebeenmadeinunder standingthemolecularpathogenesisofHCC,butonlyli…     

转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝癌细胞系的凋亡与p53及Smad4活化相关

目的:明确转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝肿瘤细胞系凋亡及其与Smad的关系.方法:选用3种含有不同p53基因状态的人肝肿瘤细胞系,应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝肿瘤细胞的凋亡进行了定量检测.为明确凋亡机制,还应用LF2000把含有Smad结合元件和荧光素酶基因的TGF-β1可诱导的荧光素酶报告质粒对细胞进行了转染,后经TGF-β1作用,分别检测其相对荧光素酶活性.结果:在应用TUNEL检测的3个细胞系中,TGF-β1仅能诱导HepG2细胞(野生型p53)凋亡,而Huh-7(突变型p53)和Hep3B细胞(缺失型p53)则凋亡较少.荧光素酶检测显示,HepG2细胞对TGF-β1反应较强,而Huh-7和Hep3B细胞其荧光素酶的表达较低.结论:HepG2细胞系比Huh-7和Hep3B细胞系更易发生TGF-β1诱导的凋亡,Smad4也许是TGF-β1信号转导途径的主要调控因子之一.     

转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝癌细胞系的凋亡与p53及Smad4活化相关

目的:明确转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝肿瘤细胞系凋亡及其与Smad的关系.方法:选用3种含有不同p53基因状态的人肝肿瘤细胞系,应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝肿瘤细胞的凋亡进行了定量检测.为明确凋亡机制,还应用LF2000把含有Smad结合元件和荧光素酶基因的TGF-β1可诱导的荧光素酶报告质粒对细胞进行了转染,后经TGF-β1作用,分别检测其相对荧光素酶活性.结果:在应用TUNEL检测的3个细胞系中,TGF-β1仅能诱导HepG2细胞(野生型p53)凋亡,而Huh-7(突变型p53)和Hep3B细胞(缺失型p53)则凋亡较少.荧光素酶检测显示,HepG2细胞对TGF-β1反应较强,而Huh-7和Hep3B细胞其荧光素酶的表达较低.结论:HepG2细胞系比Huh-7和Hep3B细胞系更易发生TGF-β1诱导的凋亡,Smad4也许是TGF-β1信号转导途径的主要调控因子之一.     

STAT3小干扰RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建以STAT3为靶基因的短发夹状小干扰RNA表达载体,并探讨STAT3小干扰RNA表达载体对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法：以pGPU6／GFP／STAT3质粒为载体,构建STAT3的小干扰RNA表达载体,使用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞系,用M1Tr法检测空白对照组、小干扰RNA组、阴性对照组与脂质体对照组的增殖活性,48h后流式细胞仪分析4组细胞周期分布与凋亡的变化,并且通过RT—PCR和Westernblot检测结肠癌HCTll6细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定和测序分析表明靶向STAT3的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染HCT116后,STAT3的mRNA和蛋白水平较空载体转染组显著下降;小干扰RNA组与3对照组相比细胞增殖活性明显受到抑制（P〈0．01）;细胞生长明显减缓,G0／G1期细胞比例增加（P〈0．01）。结论：沉默STAT3基因可有效控制结肠癌细胞的增殖,使癌细胞阻滞于G0／G1期并诱导其凋亡,可望成为结肠癌治疗的新方法。     

毛酸浆内酯通过抑制STAT3诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡

[目的]旨在探讨信号转导和转录激活因子3(STAT3)在毛酸浆内酯（PPB）诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡中发挥的作用。[方法]采用荧光染色法分析PPB诱导MCF-7细胞凋亡;使用生物信息学方法预测PPB抗乳腺癌的潜在机制;采用噻唑蓝（MTT）法考察STAT3抑制剂S3I-201以及STAT3小干扰RNA(siRNA)对PPB抑制MCF-7细胞生长的作用;采用蛋白免疫印迹（Western Blot）法考察PPB单独处理或STAT3 siRNA预处理后对MCF-7细胞中STAT3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Caspase8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase9)、细胞色素c(Cytochrome c)以及多聚ADP核糖聚合酶（PARP）蛋白表达的影响。[结果] MCF-7细胞经PPB作用后凋亡形态特征明显,凋亡比例上升;生物信息学结果显示PPB与乳腺癌疾病的共同靶点STAT3在乳腺癌组织中高表达,单基因GSEA结果提示STAT3高表达与凋亡信号通路呈负相关;Western Blot法检测结果显示PPB能够抑制STAT...     

沉默Glypican-3基因增强人肝癌细胞HepG2对5-FU致凋亡作用的敏感性

目的沉默人肝癌细胞HepG2的GPC3基因表达,观察其对5-氟尿嘧啶（5-FU）的药物敏感性及细胞凋亡情况的影响。方法①构建干扰GPC3的shRNA载体,将其转染至肝癌细胞,并设立对照组。（2）Western blot测定GPC3蛋白表达情况。③利用MTT法测定转染后肝癌细胞对5-Fu的药物敏感性。④采用流式细胞技术观察转染后肝癌细胞在5-Fu作用下的细胞凋亡情况。结果转染shRNA的肝癌细胞其GPC3表达阴性;其对5-Fu的药物敏感性增加（P〈0．05）;细胞凋亡较对照组增加（P〈0．05）。结论GPC3的高表达在肝癌细胞中起到抗凋亡作用,而下调GPC3可作为一个潜在的靶目标,增加肝癌细胞对5-Fu诱导细胞凋亡的敏感性。