转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究

用脂质体转染方法将人类α1，2岩藻糖苷转移酶(HT基因)转入猪的血管内皮细胞中(PIEC)，经G418筛选两周获得具有抗性的克隆，增殖传代，当细胞达到一定数量时消化收集，流式细胞仪检测转染细胞的表达情况。结果显示HT基因的转染是有效的，明显地提高了H抗原的表达，同时降低了α—Gal的表达，在异种移植研究中抑制超急性排斥反应(HAR)和延迟性排斥反应(DXR)均起到一定的作用。     

人α1,2岩藻糖苷转移酶基因在猪动脉内皮细胞的表达

目的通过基因工程技术使人α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因在猪动脉内皮细胞(PAEC)表达,削减异种抗原αGal的表达。方法构建pcDNA3HTcDNA重组质粒,体外培养PAEC,脂质体转染法将pcDNA3HTcDNA转染PAEC,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,对其用PCR检测重组质粒的整合,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原αGal的表达。分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照。结果重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测转染细胞H抗原表达升高,αGal表达明显降低。结论成功构建了pcD NA3HTcDNA重组质粒,并使人HT基因在PAEC表达,抑制了αGal的合成。     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α对人卵巢癌细胞的凋亡作用

目的研究过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α（PGC-1α）对人卵巢上皮癌细胞凋亡的调控作用。方法选用人卵巢癌细胞株H08910进行体外培养,实验组设3组的对照组加入绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒载体,Ad-GFP组（绿色荧光感染）,Ad-PCG-1α组（PCG-1α绿色荧光感染）采用Hoeches染色法检测细胞凋亡,并用流式细胞仪测定凋亡率。定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞内凋亡相关基因Bax和Bcl-2mRNA的表达。选用中国仓鼠正常卵巢细胞（CHO）作为对照,同样方法过表达PGC-1仪检测凋亡。结果在人卵巢癌细胞H08910中过表达PGC-1α能明显诱导细胞凋亡,光学显微镜观察到细胞凋亡,流式细胞仪测定凋亡率达58．9％。过表达PGC-1α使H08910细胞内的Bax表达上调1．5倍,而Bcl-2表达下降了69％。而在正常仓鼠卵巢细胞中过表达PGC-1α,细胞未见明显的凋亡发生。结论PGC-1α能显著诱导人卵巢癌细胞发生凋亡,促凋亡基因Bax表达上调和抗凋亡基因Bcl-2表达下降可能是诱发细胞凋亡的机理之一。PGC-1α具有特异性促肿瘤细胞凋亡的作用。     

软脂酸增加血管内皮细胞Toll样受体4表达及活化TLR4炎症信号通路

目的研究饱和脂肪酸软脂酸对血管内皮细胞Toll样受体4（TLR4）表达及信号转导的影响。方法采用软脂酸处理猪髋
动脉内皮细胞（PIECs）,实时荧光定量PCR检测PIECs TLR4 mRNA表达,蛋白印迹法检测PIECs TLR4及IκBα蛋白表达,流式
细胞仪检测PIECs细胞表面TLR4蛋白水平,酶联免疫吸附测定法检测细胞培养液TNF-α及IL-6水平。结果与对照组比较,
软脂酸组PIECs TLR4 mRNA及蛋白表达显著升高（TLR4 mRNA：4.73±0.61 vs 1.25±0.90,P<0.05;TLR4 蛋白：5.79±0.05 vs
4.07±0.31,P<0.05）,PIECs细胞表面TLR4蛋白水平显著增加（38.070±3.907 vs 29.390±1.072,P<0.05）;软脂酸组PIECs IκBα蛋
白表达显著降低（2.04±0.22 vs 3.98±0.18,P<0.05）,细胞培养液TNF-α及IL-6水平显著升高（TNF-α：2.52±0.30 vs 1.38±0.26,P<
0.05;IL-6：3.28±0.32 vs 1.44±0.28,P<0.05）。结论软脂酸在诱导血管内皮细胞TLR4表达的同时活化TLR4炎症信号通路。
     

中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达

目的克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GTcDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体。将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2。将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基(α-Gal)的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合。结果在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5。pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异(P>0.05)。结论成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体。两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料。     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体，并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段，并测序鉴定和分析转录因子结合位点（TFBS）。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1（阴性对照）和pEGFP—N1（阳性对照）分别转染正常人脐静脉内皮细胞（ECV）和不同的肿瘤细胞（肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp，序列分析与GenBank收录一致，含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示，转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达；转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达；转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达，HepG2和Hep2细胞有较强荧光，K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明，pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3．9％、21．3％、10．8％和6．5％，pEGFP-N1转染率分别为17．1％、24．0％、14．0％和11．0％，二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体，该载体可在肿瘤细胞特异性表达，但其活性需进一步加强。     

一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP

目的：寻求基因转移中快速检测转染阳性细胞的方法。方法：采用逆转录病毒介导的基因方法，将Ｉ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因、绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因及抗新霉素（ＮｅｏＲ）基因插入人外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ），利用ＧＦＰ在细胞内的表达所产生的绿色荧光，经流式细胞仪测定基因转移效率。结果：被转染结胞以Ｔ淋巴细胞为主，占１１．３９％，而且被转化的Ｔ细胞中ＣＤ４阳性细胞转化率较高，占７．６１％，ＣＤ８，ＣＤ１９和ＣＤ３３阳性细胞转化率分别为２．９％，２．１％和４．７２％，ＰＣＲ鉴定表明转染的人外周血单个核细胞中含量有ＮｅｏＲ基因。结论：在基因转移中ＧＦＰ可作为一种标记基因，快速检测转染阳性细胞。     

人类免疫缺陷病毒-1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原-Ⅰ类分子

 [目的]研究人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 nef调节细胞表面的人类白细胞抗原（HLA）-Ⅰ类分子及诱导细胞凋亡情况。[方法]将293T细胞分为两组,用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞,Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子表达及细胞凋亡情况。[结果]HIV-1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV-1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA-A,B,C-FITC染色后,平均荧光强度分别为205±22及269±15,两者相比有显著性差异（P〈0.01）;经Annexin V-APC/PI染色后,阳性细胞百分率分别为（60.82±8.32）%及（8.12±5.43）%,两者相比亦有显著性差异（P〈0.01）。[结论]HIV-1 nef下调细胞表面的HLA-I类分子及诱导细胞凋亡。     

自杀基因修饰内皮祖细胞对肝细胞癌体外作用的效应

目的：研究自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染的小鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）联合酶前体药物5-氟胞嘧啶（5-FC）对小鼠肝癌细胞株H22的体外抗增殖作用。方法：分离普通小鼠骨髓源性EPCs,培养鉴定,Polybrene技术转染含CD基因的慢病毒载体重组体plenti6．3-EGFP-CD至EPCs,Western blotting检测目的蛋白的表达。利用Transwell小室共培养体系,用转染CD基因的EPCs处理H22细胞。 CCK-8法检测H22细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：成功转染CD基因至EPCs;CCK-8法检测显示随着5-FC浓度增加,细胞增殖逐渐下降,5-FC浓度达100 mg· L-1时,肿瘤细胞增殖抑制率达到（54．74±5．38）％（P＜0．05）,细胞平均凋亡率为（48．71±4．62）％（P＜0．05）。结论：CD基因修饰的EPCs 联合5-FC体外可明显抑制肝癌H22细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。     

HIF-1α转染骨骼肌细胞的诱导产物VEGF对血管内皮细胞增殖的影响

目的：将缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因转染体外培养大鼠骨骼肌细胞,观察转染后细胞上清液中VEGF蛋白的表达及其对血管内皮细胞增殖的影响。方法：利用机械和酶消化法分离培养大鼠骨骼肌细胞,贴块法培养血管内皮细胞;用阳离子脂质体介导pHOX／HIF-1α质粒转染骨骼肌细胞,ELISA法检测转染后VEGF蛋白的分泌情况,MTT法检测其对血管内皮细胞增殖的影响。结果：成功将HIF-1α基因转染大鼠骨骼肌细胞,转染组细胞培养上清中24、48、72和96h检测到VEGF含量分别为（1308．40±102．00）、（1449．20±69．86）、（1802．30±96．71）和（1494．95±86．24）pg/ml,明显高于对照组;转染后骨骼肌细胞分泌的VEGF对血管内皮细胞有显著的促增殖作用。结论：HIF-1α基因转染大鼠的骨骼肌细胞后可增加具有正常功能的VEGF蛋白的分泌,促进血管内皮细胞的增殖。     

细胞间粘附分子-1反义DNA体外对内皮细胞细胞间粘附分子-1表达的抑制作用

目的：研究细胞间粘附分子-1（ICAM-1）反义DNA对内皮细胞ICAM-1表达的抑制作用。方法：构建ICAM-1反义DNA载体,用脂质体转染内皮细胞,TNFα刺激后,流式细胞术检测转染细胞表面ICAM-1蛋白的表达。结果：酶切鉴定证明,1.4kb的ICAM-1DNA片段反向连接到pcDNA3表达载体;流式细胞术检测显示,正常细胞加TNFα刺激后,表面ICAM-1表达明显升高（P<0.01）,转染细胞加TNFα刺激后表面ICAM-1表达无明显升高(P>0.05),转染细胞表面ICAM-1表达低于正常细胞（P<0.05）。结论：ICAM-1反义DNA体外可抑制细胞ICAM-1表达。     

rAAV2载体介导G卯基因转染树突状细胞

目的：在诱导人骨髓CD34^＋细胞分化成树突状细胞（dendritic cells，DCs）的基础上，探讨2型重组腺相关病毒（Type 2 recombinant adeno-associated virus，rAAV2）载体介导绿色荧光蛋白（green fluo-rescent protein，GFP）基因转染DCs的条件。方法：采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34^＋细胞。在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34^＋细胞生成DCs，于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟，在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs。通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞，荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达。结果：人骨髓CD34^＋细胞经诱导分化后，在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征，流式细胞仪检测到DCs表型；荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0．45％，13．54％和0．25％。结论：本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34^＋细胞诱导分化成DCs，rAAV2／GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高，且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs。     

PKR、eIF-2α在 IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用研究

目的：探讨白细胞介素24（interleukin-24,IL-24）对胶质瘤细胞凋亡的影响以及双链RNA蛋白激酶R （double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR）、真核细胞翻译起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α, eIF-2α）在其中的作用。方法将载有 IL-24基因的 Ad5F35型重组腺病毒（Ad-IL-24）及载有增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因作为对照的 Ad5F35型重组腺病毒（Ad-EGFP）转染入胶质瘤细胞U87和 U251中,应用流式细胞仪检测胶质瘤细胞 U87和 U251中的凋亡情况,并检测 U87和 U251各组中 PKR、磷酸化 PKR（phosphorylation-PKR,pPKR）、eIF-2α及磷酸化 eIF-2α（phosporylation-eIF-2α,peIF-2α）的表达情况。结果在胶质瘤细胞 U87和 U251中转染 IL-24后的细胞凋亡率为12．3％和13．0％,明显高于空白组与对照组,并且转染 IL-24的胶质瘤细胞中 PKR、pPKR、eIF-2α及 peIF-2α的表达增加。结论 IL-24可能在胶质瘤细胞中通过上调 PKR、eIF-2α的表达及其活化,促进胶质瘤细胞凋亡。     

重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α转染大鼠内皮祖细胞

目的：研究含缺氧诱导因子（HIF-1α）及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组腺病毒（Ad-EGFP/HIF-1α）感染大鼠内皮祖细胞（EPCs）的可行性.方法：采用percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,VEGF,bFGF,EGF诱导培养,观察其形态学变化,免疫细胞化学染色鉴定其表面抗原.Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后转染体外培养的EPCs,分别于24,48,72,96h采用倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）情况.MTT检测细胞生长活性;流式细胞术检测转染率并用RT-PCR法测定HIF-1α在EPCs中的表达.结果：倒置荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,随着时间的延长,绿色荧光逐渐增多.MTT法检测细胞在24,48,72,96h的存活率分别为99.83%,99.70%,99.32%,99.57%;流式细胞仪计数随时间的延长,转染率逐渐升高,24,48,72,96h的转染率分别为23.05%,45.94%,78.91%,85.64%.RT-PCR可检测到被感染细胞HIF-1α的表达.结论：重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α能够有效地感染EPCs,转染后在mRNA水平可检测到EPCs中有HIF-1α的表达,并对EPCs活性无明显影响,为进一步研究转基因的EPCs移植促血管新生奠定基础.     

Livinα基因特异性shRNA在乳腺癌细胞MCF7中的表达鉴定

目的：研究凋亡抑制因子α（ Livinα）特异的短发夹状 RNA（ shRNA）在MCF7乳腺癌细胞中对外源 Livinα基因表达的抑制作用。方法构建4组EGFP－Livinα融合表达的重组质粒,其中两组分别含shRNA 1、shRNA2对应的不同序列的cDNA干扰片断,分别电转染入MCF7乳腺癌细胞中,48h 后用荧光显微镜观察各实验组细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测转染后各组细胞的平均荧光强度。应用逆转录－聚合酶链反应（ RT－PCR）检测各组细胞中Livin α在RNA水平和蛋白水平的表达。结果酶切及测序证实质粒构建成功;荧光显微镜观察结果显示载体成功转染入MCF7乳腺癌细胞;干扰片段shRNA2可有效抑制目的基因mRNA的表达。结论成功构建的含目的基因有效干扰片断的质粒可抑制目的基因在MCF7乳腺癌细胞中的表达。     

端粒酶启动子肿瘤靶向TNF相关凋亡诱导配体基因抗大肠癌细胞HT-29的活性研究

目的：探讨在端粒酶（hTERT）启动子驱动下TRAIL基因在大肠癌细胞HT-29的表达及其杀细胞作用。方法：通过腺病毒载体系统将hTERT启动子驱动的TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因转入大肠癌细胞HT-29，流式细胞仪检测GFP／TRAIL的表达和HT-29细胞凋亡率。结果：端粒酶启动子驱动的GFP／TRAIL基因和CMV启动子驱动的GFP（绿色荧光蛋白）基因在HT-29内的表达率分别达31．4％和67．0％；GFP／TRAIL基因对HT-29细胞的生长抑制率和凋亡率分别达74．2％和25．8％，与PBS和Ad／CMV—GFP比差异都有显著性意义（P〈0．05）。结论：端粒酶启动子驱动的GFP／TRAIL融合基因能在大肠癌细胞中有效表达；TRAIL基因对大肠癌细胞HT-29有明显的抑制生长和促凋亡作用。     

mdr1基因转染K562细胞株的高效及安全性实验

目的：mdr1基因转染K562细胞株，了解转染的持续稳定性、功能性及安全性。方法：磷酸钙沉淀法建立一株双向性产病毒包装细胞，浓缩病毒上清液法感染K562细胞．分别用集落筛选法、流式细胞仪及SP免疫组化法检测转染率，柔红霉素泵出实验及MTT法测定外源性Pgp功能，流式细胞仪测细胞周期及PI分析，免疫组化测bcl-2、c-myc的表达，柱形图、折线图及配对t检验进行统计学分析。结果：①最高转染率为34％，秋水仙碱筛选后达84％．②外源性mdr1基因可持续表达4月多，但表达率及强度逐渐降低。④转染的mdr1基因产物Pgp具有外排泵功能①被转染的K562细胞获得1．46～2．22倍的多药耐药功能。⑤转染行为对靶细胞生长、增殖、凋亡呈一过性、轻度的、可逆的影响。结论：mdr1基因转染K562细胞获得外源性Pgp高效、持久、功能、安全地表达，这为进一步研究mdr1基因修饰的骨髓移植在化疗中保护骨髓免受化疗损害奠定了基础．     

α1,2-岩藻糖转移酶基因转染增加卵巢癌细胞系RMG-Ⅰ Lewis y抗原的表达

目的将人α1,2-岩藻糖基转移酶（α1,2-FT）基因转染卵巢癌细胞系RMG-Ⅰ并探讨细胞表面Lewisy及其他相关糖脂抗原的变化。方法采用PCR方法克隆人α1,2-FT基因编码区HFUT-H,构建表达载体pcDNA3.1（-）-HFUT-H,利用磷酸钙法将其转染入卵巢癌细胞系RMG-Ⅰ,建立α1,2-FT基因稳定高表达细胞株RMG-Ⅰ-H。通过酶活性测定证明转染前后细胞系α1,2-FT活性的改变,采用薄层层析、薄层层析免疫染色方法测定转染前后细胞脂质及糖脂,特别是Ⅱ型寡糖的变化。结果基因转染后细胞RMG-Ⅰ-H中H-1抗原及Lewisy抗原显著增加,特别是Lewisy抗原为转染前的20倍;而Ⅰ型糖链Lewisb显著减少。转染前后细胞膜上的主要脂质成分胆固醇和磷脂质的含量没有变化,且中性糖脂质也没有明显变化。结论α1,2-FT基因转染增加α1,2-FT活性的同时,增加卵巢癌细胞系RMG-Ⅰ Lewisy抗原的表达;RMG-Ⅰ Lewisy高表达细胞系的建立为研究Lewisy抗原与卵巢癌生物学行为提供了细胞模型。     

转录因子SP1诱骗性寡核苷酸对猪血管内皮细胞α半乳糖苷链表达的影响

目的:探讨转录因子SP1诱骗性寡核苷酸(decoy ODN)对猪血管内皮细胞系(SV-40-PED)膜蛋白α半乳糖苷链(αGal)表达的影响。方法:SP1诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞系,细胞爬片后荧光显微镜下观察αGal抗原表位的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况;RT-PCR法检测SV-40-PED转染前后α1,3半乳糖转移酶(α1,3GT)mRNA。结果:荧光显微镜下细胞爬片可见转染组(decoy ODN组)细胞膜荧光表达明显减弱,部分部位可见点状荧光缺损。Western blot显示decoy ODN/PED的αGal相对吸光度值为48.2±0.9,仅为空转染组(只含有转染试剂oligofectamine)91.6±1.7的52.6%(P<0.05)。转染组α1,3GT基因异构体的mRNA表达量(异构体1为0.42±0.20;异构体2为0.27±0.12)显著低于空转染组(异构体1为0.72±0.17;异构体2为0.50±0.19;P<0.05),但错配组(错义decoy ODN组)及空转染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SP1 decoy ODN可以靶向性抑制猪血管内皮细胞系αGal基因的表达。     

缺氧诱导因子-1α对人卵巢颗粒细胞KGN能量代谢的影响及作用机制研究

目的：探究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人卵巢颗粒细胞KGN能量代谢的影响及作用机制。方法：将KGN细胞随机分为KGN组（细胞不做任何处理），si-NC组（转染阴性对照si-NC）和si-HIF-1a组（转染siRNA si-HIF-1a）。利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测HIF-1a、线粒体DNA(mtDNA)及己糖激酶（HK2）的mRNA表达；蛋白质免疫印迹法（western blotting）检测HIF-1α蛋白表达；细胞计数试剂盒（CCK-8）检测各组细胞的增殖活力；流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率；线粒体超氧化物（MitSOX）荧光染色检测各组细胞内的线粒体活性氧（ROS）含量；5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基碳氰碘化物（JC-1）荧光染色检测各组细胞膜电位；三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒检测各组细胞内ATP含量。结果：低表达HIF-1a可以降低KGN的细胞增殖活力（P<0.01），增加细胞的凋亡率（P<0.01）；同时细胞外酸化率显著增加（P<0.01），而糖酵解关键酶...