丙型肝炎病毒E2蛋白作为酵母双杂交体系饵载体的构建及表达

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus,HCV)胞膜蛋白 2 (envelopeprotein 2 ,E2 )胞外区片段 ,构建酵母双杂交体系中“饵”载体 ,明确其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用 ,验证其能否用于酵母双杂交体系筛选cDNA文库。方法 :设计引物 ,从本室构建的含中国株Ⅲ型HCVE2片段的载体上 ,扩增出不包含C末端跨膜区的E2片段E2 6 6 1,经EcoRI和PstI双酶切后 ,克隆到酵母双杂交的“饵”载体pAS2 1质粒上 ,构建成载体pAS2 1 E2 6 6 1。阳性克隆经EcoRI和PstI双酶切鉴定后 ,转入酵母中 ,用酵母蛋白抽提物作Western杂交 ,证实其表达 ;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用。结果 :所构建的载体 pAS2 1 E2 6 6 1双酶切后 ,片段大小正确 ;转入酵母后 ,提取酵母质粒 ,PCR扩增出预期大小的片段 ,Western杂交出现阳性条带 ;滤膜杂交 ,转有 pAS2 1 E2 6 6 1和阴性对照pLAM5 ' 1的酵母菌落没有激活报告基因 ,而GAL4全长的阳性对照菌落变为蓝色。结论 :含有HCVE2 6 6 1的“饵”载体构建正确 ,在酵母细胞中能表达出E2蛋白 ,并且没有自身激活报告基因的功能 ,能够应用于酵母双杂交体系。     

丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用

目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）Ｅ２包膜蛋白,并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测ＨＣＶＲＮＡ阳性血清中Ｅ２抗体,研究其检测Ｅ２抗体的敏感性和特异性,方法：将ＨＣＶＥ２蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌。用ＩＰＴＧ诱导细菌表达Ｅ２蛋白,经离子交换层析纯化蛋白,用纯化的包膜蛋白包微孔板,经ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＣＶＲＮＡ阳笥血清中的Ｅ２抗体,结     

不同基因型的丙型肝炎病毒E2蛋白生物信息学分析

目的对不同基因型的丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白进行生物信息学比较分析。方法从GeneBank中获取不同基因型HCV的E2蛋白核苷酸与氨基酸序列,运用DNA Star,Clustal X,BioEdit等国际通用软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸和氨基酸同源性,应用AntheProt5.0软件分析HCV E2蛋白二级结构。结果不同基因型E2蛋白氨基酸数在HCV蛋白中所占比例为10.93%~11.65%。不同基因型间E2蛋白基因核苷酸同源性为61.1%~74.8%,氨基酸同源性为64.0%~82.2%;不同基因型E2蛋白氨基酸序列比对显示3个高变异区域,分别为aa1~aa28(突变率为71.4%)、aa74~aa101(突变率为71.4%)和aa189~aa205(突变率为88.2%);不同基因型E2蛋白均富含潜在α螺旋(11%~21%)、β折叠(29%~43%)和卷曲结构(43%~51%)。结论不同基因型的HCV E2蛋白存在较大异质性。 更多还原     

基因免疫诱导小鼠产生抗丙型肝炎病毒E2糖蛋白抗体

目的：通过基因免疫诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生抗Ⅲ型中国株ＨＣＶ来源Ｅ２糖蛋白的体液免疫应答。方法：质粒ｐ３Ｗ１４在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中能够表达Ｅ２糖蛋白，纯化该质粒并用于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠直接肌注，于加强注射后不同时相采血，以重组的Ｅ２糖蛋白检测特异性抗Ｅ２抗体。结果：接种ｐ３Ｗ１４质粒的小鼠中可检出抗Ｅ２抗体（５／６），抗体滴度１∶１５～１∶１２０。结论：采用含Ｅ２／ＮＳ１基因的质粒ＤＮＡ免疫，成功地诱导小鼠产生抗Ⅲ型株来源的Ｅ２抗体。     

丙型肝炎病毒E2及preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ基因与ｐｒｅＳ２基因嵌合,嵌合基因免疫小鼠能产生抗ＨＣＶＣ蛋白的抗体,而单独接种ＨＣＶＣ基因则不能诱导小鼠产生抗Ｃ蛋白的抗体［１］。为研究ｐｒｅＳ能否增加ＨＣＶＥ２蛋白的免疫原性提供物质基础,我们在哺乳动物细胞稳定表达了Ｅ２?..     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

丙型肝炎病毒E2基因激发小鼠细胞免疫的实验研究

目的 :研究丙型肝炎病毒E2基因接种能否诱导机体产生细胞免疫以及乙型肝炎病毒preS基因对其诱导细胞免疫能力的影响。方法 :以BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞株 (SP2 /O)为宿主细胞 ,建立表达丙肝病毒E2蛋白的靶细胞 ,将其注射于E2基因或 preS与E2融合蛋白基因免疫的小鼠腹腔 ,记录小鼠接种瘤细胞后的存活期 ,以小鼠存活期的长短作为反映基因免疫小鼠对HCVE2蛋白细胞免疫的有无或强弱的指标。结果 :靶细胞表达了相对分子质量约为 70 0 0 0的E2蛋白 ,E2基因接种小鼠的存活期长于对照组 ,单独E2基因接种组的存活期显著长于对照组 ,也长于 preS与E2融合蛋白基因免疫组。 结论 :E2基因接种能诱导细胞免疫 ,但与 preS融合后 ,其诱导细胞免疫的能力会降低。     

不同基因型丙型肝炎病毒E1、E2蛋白生物信息学分析

目的对不同基因型的丙型肝炎病毒(HCV)的E1、E2蛋白进行生物信息学比较分析,以找出重要的生物信息学数据。方法从Gene Bank中获取不同基因型HCV的E1、E2蛋白核苷酸与氨基酸序列,运用DNA Star,ClustalX,Bio Edit等国际通用的软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸和氨基酸同源性。在线软件TMHMM v2.0分析E1、E2蛋白跨膜区。AntheProt5.0软件分析二级结构。结果 E1氨基酸起始于aa 193—aa196和终止于aa 382—aa 383,E2蛋白氨基酸起始于aa 384和终止于aa 744—aa 754。不同基因型间E1、E2蛋白基因核苷酸同源性为59.7%~77.0%,氨基酸同源性为60.6%~82.8%。E1、E2蛋白存在3个跨膜区:E1存在2个跨膜区,位于aa 273—aa 293和aa 363—aa 383;E2蛋白存在1个跨膜区,位于aa 723—aa 744。二级结构分析发现不同型HCV E1、E2蛋白富含α螺旋(21%~30%),β折叠(26%~36%)和卷曲结构(43%~48%)。结论HCV E1、E2核苷酸和氨基酸序列表现为较大的异质性,其蛋白跨膜区富含α螺旋,胞外区以β折叠为主。     

酵母双杂合体系验证与丙型肝炎病毒E2蛋白相作用的蛋白

丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)是导致经血液传播非甲非乙型肝炎的主要病原,具有很强的宿主特异性,这有碍ＨＣＶ的体外培养及对病毒生活周期的研究,而其宿主特异性又决定于病毒入胞水平。因此,对ＨＣＶ的入胞机制的研究就尤为关键。ＨＣＶＥ2是ＨＣＶ病毒表面蛋白的主要组成部分并含有中和位点。被认为是ＨＣＶ与靶细胞相结合的位点。Ｅ1与Ｅ2在结构上是紧密相关的[1],由于上述两个原因,我们能够单独研究Ｅ2蛋白,来寻找与Ｅ2蛋白相作用的配体,据报道[2],丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)可能是通过肝细胞膜上的低密度脂蛋白受体(ＬＤＬＲ)进入肝细胞的,ＬＤＬＲ…     

基因免疫诱导小鼠产生抗丙型肝炎病毒E2糖蛋白抗体

目的：通过基因免疫诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生抗Ⅲ型中国株ＨＣＶ来源Ｆ２糖蛋白的体液免疫应答，方法：质粒ｐ３Ｗ１４在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中能够表达Ｅ２糖蛋白，纯化该质粒并用于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠直接肌注，于加强注射后不同时相采血，以重组的Ｅ２糖蛋白检测特异性抗Ｅ２抗体。结果；接种ｐ３Ｗ１４质粒的小鼠中检出抗Ｅ２抗体（５／６），抗体滴度１：１５～１：１２０。结论；采用含Ｅ２／ＮＳ１基因的质粒ＤＮＡ免疫，成功地诱