人Leptin的cDNA克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

Leptin是近年来发现的调节机体内分泌和能量代谢的最重要的肽类激素,其由脂肪细胞合成、分泌,作用于下丘脑的Leptin受体,促进下丘脑神经肽的分泌,或直接作用于靶细胞的Leptin受体,产生广泛的生物学效应.     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以超速离心法提取的HepG2细胞总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到编码人干细胞因子（SCF）全长CDNA（约0.8kb）。克隆、序列分析确证编码人SCF膜外活性区的CDNA（约0.5kb）结构正确，构建了含有该基因的表达质粒（PBV-mhSCF）并在大肠杆菌中获得高效表达。     

人白细胞介素18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

获得ＩＬ－１８全长ｃＤＮＡ序列，研究ＩＬ－１８在大直菌中的表达。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ方法人人外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素的ｃＤＮＡ，以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测序。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR法）从人脐静内皮细胞RNA中扩增了表皮生长因子（EGF）的cDNA，采用基因重组技术克隆到pGEM－3zf（＋）载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在PCR扩增引物上分别加有起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA），以利于原核表达。经亚克隆，EGFcDNA克隆到表达载体pBV220的EcoRI、SmaⅠ位或上，在大肠杆菌DH5α中进行表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明其表过量约占菌体总蛋白的10％。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

赖型钩体内鞭毛基因的扩增、克隆、核苷酸序列测定及其在大肠杆菌中的表达

根据钩体内鞭毛蛋白（Ｅｎｄｏｆｌａｇｅｌｌｉｎ）ｆｌａＢ基因核苷酸序列自行设计一对引物，以赖型钩体ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ扩增到约８４０ｂｐ的片段。扩增片段经酶切（ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ）定向克隆入ｐＵＣ８。重组质粒ｐＬＦ１插入片段与哈勒焦型钩体ｆｌａβ基因相比，核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性很高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明有一约３３ｋｄ的特异蛋白带，表达量占菌体蛋白１１％。免疫印迹试验表明此区带能被抗赖型钧体内鞭毛（轴丝）抗血清识别。首次以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠钧体病模型为基础，用含重组质粒ｐＬＦ１的大肠杆菌作免疫原进行免疫保护试验，实验组存活率高子对照组，表现了一定程度的保护作用。本研究结果在所查国内外文献中尚属首次报道。     

谷胱甘肽合成酶在大肠杆菌中的高效表达及性质

在成功构建了谷脱甘肽（ＧＳＨ）合成酶基因表达质料（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）的基础上，对不同大肠杆蓖突主菌进行了比较，筛选出高效、稳定表达ＧＳＨ合成酶的工程菌并进行了最佳酶表达条件的研究。结果表明：重组工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＴｒｃ－ｇｓｈ）表达量最高，质粒稳定性好；以５％接各量于３７℃、ｐＨ７．２培养至ＯＤ５５０＝０．５左右，加入诱导剂ＩＰＴＧ（０．ｍｍｏｌ／Ｌ），同时切换培养条件为３４℃、ｐＨ６     

人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体，获得TR蛋白。方法：采用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人胚脑组织中扩增出TRcDNA片段，克隆至pGEM—T载体并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pGEM—TR；经序列分析证实后，提取pGEM—TR重组体，由双酶切得到目的片段，并插入pET9c原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组质粒pET—rhTR。异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导pET—rhTR在BL21中表达，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果：克隆的TRcDNA与人胎盘组织TRcDNA同源性为99％；pET—rhTR在大肠杆菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的36％，其分子质量为55ku。TRcDNA序列被GenBank收录，登录号为AF208018。结论：成功克隆了人脑组织来源的TR基因，该基因在大肠杆菌中得到高表达，为进一步研究其功能奠定基础。     

人淋巴毒素cDNA克隆及其在大肠杆菌表达的研究

人淋巴毒素ｃＤＮＡ克隆及其在大肠杆菌表达的研究ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉｏｆｃＤＮＡｆｏｒｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ张津利朱锡华（第三军医大学基础部免疫学教研室）重庆，６３００３８淋巴毒素（ＬＴ或ＴＮＦ－β）系由淋...     

酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌 ,为酶促转化法生产S 腺苷甲硫氨酸奠定基础。方法　应用PCR技术从S 腺苷甲硫氨酸高产酿酒酵母染色体DNA中扩增得到S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因sam2 ,将其克隆至表达载体pT7 7,转化大肠杆菌 ,1%琼脂糖电泳比较大小 ,筛选重组子。结果　SDS PAGE显示重组菌S 腺苷甲硫氨酸合成酶亚基分子量约为 4 2KDa ,平均表达量约占菌体总可溶性蛋白的 4 2 % ,酶活达到 14 .1U/g湿菌体 ,比宿主菌酶活提高 15 .7倍。结论　酿酒酵母SAM合成酶基因在大肠杆菌中高效表达 ,重组菌已具有初步的工业化应用价值     

脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆表达及酶活力测定

目的:在大肠杆菌中高效表达脱氢奎尼酸合成酶。方法:以大肠杆菌基因组为模板,采用PCR扩增得到脱氢奎尼酸合成酶基因aroB,并在大肠杆菌中进行表达。结果:在浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后aroB基因表达量占菌体总可溶性蛋白40.0%,SDS-PAGE显示重组菌诱导后表达的脱氢奎尼酸合成酶蛋白分子量约为38 kDa,发酵液中脱氢奎尼酸合成酶的酶活力达到178 U/L,为宿主菌的35.6倍。结论:脱氢奎尼酸合成酶在大肠杆菌中实现了高效表达。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

人PPARγ2 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

目的克隆中国人的PPARγ2 cDNA,并在大肠杆菌中进行表达纯化.方法从正常人面部脂肪组织分离总RNA,采用RT-PCR及序列测定等方法获得人的PPARγ2 cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达;在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Western blot分析和用Ni2 -NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析.结果获得了正常中国人的PPARγ2 cDNA,并成功构建了高效原核表达质粒pET28a-PPARγ2;Western blot结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量为56×103的PPARγ2目的蛋白;表达产物经Ni2 -NTA离子交换树脂纯化,PPARγ2蛋白的纯度大于90%以上.结论克隆得到正常中国人PPARγ2 cDNA的序列与Genebank报道的序列一致,并且在E.coli中成功表达和纯化了PPARγ2蛋白.此研究为后续PPARγ2功能活性和配体的筛选实验奠定了基础.     

狂犬病毒核蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的构建原核表达系统对狂犬病毒（RV）CVS株的核蛋白（NP）进行表达，并对其进行初步的血清学鉴定。方法以重组质粒Teasy—RVNP为模板，利用PCR方法扩增狂犬病毒（RV）CVS株核蛋白（NP）的DNA片段，并重组入原核高效表达载体PET-15b。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。在大肠杆菌BL21中进行表达。结果SDS-PAGE电泳结果表明，在51KDa处有一条蛋白表达带Western-blot分析证明，51KDa蛋白带可与抗体血清发生特异性反应。结论成功构建了PET-15b，NP原核表达载体，表达产物为狂犬病毒核蛋白，为生产纯度高且价廉的RVNP抗原奠定了基础。为制备测定RVNP抗体的免疫诊断试剂提供了条件。     

鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的克隆及表达

为探索鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的高效表达条件，我们将鱼抗冻肽基因克隆到原核高效表达载体Ｐ＾ｋｋ２２３－３上，筛选到８个重组克隆，经转化大肠杆菌ＤＨ５α，ＩＰＴＧ诱导５￣６ｈ，超声裂解细菌产物，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳胶带中分子量９ＫＤ处显示一条表达产物带，证明插入的抗冻肽基因已表达，含量占菌体总蛋白的１０％左右     

人IL—2cDNA的亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的构建重组人IL－2表达质粒并观察其在大肠杆菌中的表达效率。方法应用重组DNA技术，将人IL一2cDNA亚克隆于pKK223－3表达载体，构建成pKK223－3－IL－2重组表达质粒，转化JM105受体菌后得到工程菌，命名为JM105／PKK223－3－IL－2。结果凝胶电泳和核酸杂交证实，人IL一2cDNA已成功地插入到pKK223－3质位的EcoRI－HindIII位点。在异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导下，工程菌中重组人IL－2表达效率为26％；诱导8h，IL－2的产量达峰值；用含TritonX100的缓冲液反复洗涤，获得纯度很高的包含体。结论人IL-2cDNA在tac启动子控制不能在大肠杆菌中高效地表达人IL-2。     

人Leptin的cNA克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

Leptin是近年来发现的调节机体内分泌和能量代谢的最重要的肽类激素,其由脂肪细胞合成、分泌,作用于下丘脑的Leptin受体,促进下丘脑神经肽的分泌,或直接作用于靶细胞的Leptin受体,产生广泛的生物学效应。Leptin具有调节脂肪细胞的分化和细胞内脂肪酸代谢的作用。通过转录调节因子,提高脂肪细胞中脂肪酸氧化酶的表达,下调脂质合成酶的表达水平,促进脂肪酸的氧化代谢,逆转脂肪细胞的分化,使成熟的脂肪细胞标志aP2、TNTα和     

人骨形成蛋白cDNA 1,2A和3在大肠杆菌中的克隆、表达及活性

骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,简称BMP)是一类可以诱导异位宿区间充质细胞分化成软骨和骨细胞的蛋白质,在促进骨修复中具有较高的应用价值,为了在大肠杆菌中有效地表达人BMP,我们将人BMP1,BMP2A和BMP3的cDNA分别插入表达载体中,获得预期结果。1 材料和方法 人骨形成蛋白cDNA 1,2A和3由口腔医学院杨连甲教授赠送,表达载体pBV220由张德震博士赠送,表达载体pSM43由陈苏民教授构建.人BMP1 cDNA先以“缺口双链”定位插入突变技术,将其5’端信号肽序列去掉,并引入起始密码ATG,将经改造的人BMP1 cDNA 5’端1.44