红景天苷对TNF-α诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用及其意义

目的：探讨红景天苷对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）增殖的抑制作用,阐明其控制类风湿关节炎（RA）的分子机制。方法：体外培养HFLS-RA,采用TNF-α及不同浓度红景天苷处理细胞,分为正常对照组（0.0μg·L^-1TNF-α）、模型对照组（10.0μg·L^-1TNF-α）及12.5、25.0、50.0、100.0μmol·L^-1红景天苷组（10.0μg·L^-1TNF-α＋相应浓度红景天苷）。MTT法检测HFLS-RA的增殖活力,ELISA法检测细胞上清液中β-catenin、基质金属蛋白酶7（MMP-7）和Cyclin-D1表达水平,Western blotting法检测细胞中β-catenin蛋白表达水平。结果：与正常对照组比较,模型对照组HFLS-RA增殖活力明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较,12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组HFLS-RA增殖活力虽降低,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组HFLS-RA增殖活力降低（P<0.05）。与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较,12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平虽降低,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50和100μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测,模型对照组细胞中β-catenin蛋白表达水平明显高于正常对照组（P<0.01）;12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平虽低于模型对照组,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平低于模型对照组（P<0.05）。结论：红景天苷可抑制HFLS-RA的增殖,其控制RA的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关联。     

新雷公藤衍生物雷藤舒对类风湿关节炎滑膜细胞基因表达的影响

目的:研究新雷公藤衍生物雷藤舒[(5R)-5-hydroxytriptolide,LLDT-8]对肿瘤坏死因子(TNF)-α联合白介素(IL)-17诱导的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)信号通路的调节作用。方法:体外培养RA FLS,根据干预措施不同分为实验组和对照组。实验组加入LLDT-8+DMEM培养液,对照组加入等容量DMEM培养液;培养24 h后,实验组和对照组同时加入含TNF-α、IL-17的DMEM培养液;刺激12 h后,收集细胞,分离获取总RNA。采用Aglient基因表达谱芯片检测RA FLS基因表达的变化,利用KEGG数据库分析LLDT-8对RA FLS Pathway的影响。结果:(1)LLDT-8干预TNF-α联合IL-17诱导RA FLS后差异表达基因共408条,其中上调基因119条,下调基因289条。(2)LLDT-8能调控TNF-α联合IL-17诱导的RA FLS的细胞因子受体通路、趋化因子信号转导通路、Toll样受体通路、TNF信号通路、核因子-κB(NF-κB)信号通路、JAK-STAT信号通路等多条RA相关通路。结论:LLDT-8可能通过双向调节细胞因子受体通路、趋化因子信号转导通路,下调Toll样受体、NF-κB、JAK-STAT等信号通路达到抗RA作用,为进一步临床运用提供实验依据。     

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的表观遗传学研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其基本病理改变为滑膜炎。滑膜成纤维细胞(FLS)是关节滑膜衬里层的主要构成组分,并具有侵袭性表型的表观遗传印记特征,可促进RA的关节破坏。近年来,表观遗传学对RA FLS功能的影响越来越受到广泛关注,靶向FLS的治疗也为RA提供了新的治疗方向。作者综述表观遗传学在RA FLS中的研究进展,为RA的治疗提供个体化的思路。     

类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞的差异蛋白质谱分析

目的 应用双向凝胶电泳-质谱法分析正常人及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜成纤维细胞蛋白质组表达差异,探讨差异蛋白在类风湿关节炎发病中的作用.方法 采用固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离正常人及类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞总蛋白质,银染显色,PDQuest软件分析图像,比较两种细胞蛋白质组表达差异,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定,并用Western blot验证部分表达差异蛋白质.结果 ①采用窄范围的pH 4～7 IPG胶条进行2-DE分析,正常人及RA患者滑膜细胞蛋白胶图上分别平均显示852、837个点.有49个蛋白点在正常、RA滑膜细胞间有2倍以上的显著性量变.②分别在胶图上共选取40个表达水平存在明显差异的蛋白质点进行质谱鉴定,鉴定出23个在RA患者滑膜细胞中表达上调蛋白质.Western blot验证Enolaseα、Annexin Ⅰ、Cathepsin D、SOD2、Peroxiredoxin 2在RA滑膜细胞中表达显著升高.结论 正常人及类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞表达蛋白质组存在差异.这些差异蛋白可能参与类风湿关节炎的发病.     

三七总皂苷抑制人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞系增殖和促凋亡

目的:探讨三七总皂苷对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的的影响及可能机制。方法:MH7A细胞用不同剂量(0.5、1.0、2.0mg/mL)三七总皂苷干预细胞24h后,CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭,蛋白质印迹法检测蛋白(Ki-67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin)的表达,qRT-PCR法检测miR-335-5p表达。转染miR-335-5p模拟物、转染miR-335-5p抑制剂至MH7A细胞后再用2.0mg/mL三七总皂苷干预24h,然后采用上述相同方法检测细胞增殖、迁移和侵袭。结果:与对照组比较,三七总皂苷降低MH7A细胞A值、划痕愈合率、侵袭数及Ki-67、PCNA和N-cadherin蛋白表达量(P<0.05),而提高细胞凋亡率、E-cadherin蛋白表达量(P<0.05),同时促进细胞中miR-335-5p表达(P<0.05)。上调miR-335-5p后,MH7A细胞A值、划痕愈合率、侵袭数及Ki-67、PCNA和N-cadherin蛋白表达量均降低(P<0...     

雷公藤红素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中RANKL､OPG及炎性因子表达的影响

目的:观察雷公藤红素(Celastrol,Cel)对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞系MH7A细胞中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)?骨保护素(OPG)?白细胞介素-6(IL-6)?肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素-8(IL-8)表达的影响?方法:以白细胞介素-1β(IL-1β)刺激MH7A,不同浓度的Cel(0.1?0.5?1.0?2.0 μmol/L)干预细胞24 h后,采用real-time PCR和免疫荧光的方法检测RANKL?OPG?IL-6?TNF-α及IL-8的表达?结果:IL-1β刺激MH7A细胞系24 h后,RANKL?OPG?IL-6?TNF-α及IL-8 mRNA及RANKL免疫荧光明显增强,Cel呈剂量依赖性抑制MH7A中IL-1β诱导的RANKL?OPG?IL-6?TNF-α及IL-8 mRNA水平(P < 0.05)和MH7A中RANKL免疫荧光表达,显著上调OPG/RANKL轴比值?结论:Cel能调节滑膜成纤维细胞中OPG/RANKL轴和抑制促炎因子?趋化因子的表达,可能在阻止类风湿关节炎“炎症”和“骨侵蚀”中发挥重要作用?     

类风湿关节炎患者血清中RF和TNF-α表达的临床意义

〔目的〕探讨类风湿关节炎患者血清中RF和TNF-α在诊断及临床疗效评价中的意义。〔方法〕选取2013年1月至2015年1月开封市第二人民医院收治的RA患者128例,根据DAS28评分及临床症状分为RA活动期患者(66例)、RA缓解期患者(62例)作为试验组;随机选取门诊健康就诊者60例作为对照组。检测RA活动组、缓解组、对照组患者的RF抗体和TNF-α等各项指标,进行统计学分析。〔结果〕RA活动组和缓解组患者血清的RF和TNF-α水平均高于健康对照组。RA活动组血清TNF-α水平明显高于缓解组,差异有统计学意义(P<0.05)。128例RA组患者中RF和TNF-α的灵敏度分别为80.5%、72.2%,特异性分别为71.2%,90.5%,TNF-α和RF联合检测的灵敏度和特异性分别为71.2%、96.7%,特异性较两项单独检测时明显提高。TNF-α与RA的DAS28评分成正相关,差异有统计学意义(P<0.01)。〔结论〕联合检测RA患者血清中的RF和TNF-α水平对患者的治疗效果和病情监测有重要临床价值。     

TNF-α对银屑病患者成纤维细胞基因表达的影响

目的:探讨银屑病患者皮肤成纤维细胞在TNF-α作用下基因表达的变化。方法:体外培养银屑病患者皮肤成纤维细胞,以TNF-α刺激为实验组,以正常培养为对照组;用GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片分析TNF-α作用下成纤维细胞基因表达情况。结果:差异表达基因共有730条,其中上调基因395条,下调335条。差异基因主要参与合成、分解、加工修饰、代谢、运输、调控、分子复合、信号传导、细胞周期与细胞凋亡、发育、免疫等过程。结论:运用基因芯片技术研究成纤维细胞在TNF-α作用下基因表达的变化,可能为探讨银屑病的病因和发病机理的研究提供新的思路。     

类风湿关节炎与W nt信号通路抑制因子的关系

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis ,RA ）作为一种慢性、多系统性、侵袭性、进行性自身免疫性疾病,病程长,难治愈,严重威胁人类健康,影响生活质量,甚至减少患者预期寿命。目前临床上常用治疗RA的药物包括非甾体类抗炎药、糖皮质激素和传统改善病情抗风湿药（diseose‐modifying anti‐rhumatic drugs ,DMARDs）、生物制剂等,但这些药物的应用均存在各种问题,如不能迅速控制患者病情进展、药物近远期毒副作用大或疗效不确切、价格昂贵等［1‐2］。最近的一些研究发现,R A相关信号通路在RA的发病中发挥重要作用,特别是Wnt信号通路可能发挥关键作用。因此,该通道的研究已成为最近的一个热点［3‐5］。本文主要总结近年来Wnt信号通路抑制因子在RA发病机制中所起作用的相关研究,并简要分析该信号通路抑制因子相关药物的应用前景。     

miR-21对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖与凋亡的影响

探讨miR-21对类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞（FLS）增殖与凋亡的影响。方法 Realtime PCR方法检测正常和RA-FLS中miR-21表达差异。RA-FLS分成Control组、miR-NC组（转染mimics control）、miR-21组（转染miR-21 mimics）、miR-21+IGF-1组（转染miR-21 mimics,PI3K/Akt信号通路特异性激活剂IGF-1处理）,CCK-8实验分析细胞增殖活性变化,流式细胞术分析细胞凋亡水平变化,Western blot方法分析细胞中C-Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达变化。结果 与正常-FLS比较,RA-FLS中miR-21表达水平降低（P＜0.05）。与Control组、miR-NC组比较,miR-21组RA-FLS细胞中miR-21表达水平升高,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率增加,细胞中C-Caspase-3、Bax蛋白表达增多,Bcl-2蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白水平降低（P＜0.05）。与miR-21组比较,miR-21+IGF-1组RA-FLS增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达增多,C-Caspase-3、Bax蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增多（P＜0.05）。结论 上调miR-21可抑制RA-FLS增殖,诱导细胞凋亡,机制可能与降低PI3K/Akt信号激活水平有关。     

滑膜成纤维细胞的原代培养及生物特性

目的研究滑膜成纤维细胞的原代培养方法及生物特性。方法收集行关节腔镜术或关节置换术的患者的膝关节滑膜标本,其中类风湿关节炎、骨关节炎、关节创伤病例各6例,分别采用酶消化法、组织块法进行滑膜成纤维细胞的原代培养并进行生物特性的观察及鉴定。结果总共有6例类风湿关节炎、4例骨关节炎、4例关节创伤患者关节滑膜成功培养出成纤维样滑膜细胞,其中9例应用酶消化法,5例应用组织块法,经鉴定成纤维样滑膜细胞的纯度99%。结论本课题成功应用酶消化法和组织块法进行滑膜成纤维细胞的原代培养,所培养细胞适用于进行滑膜成纤维细胞相关的研究。     

紫草素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的观察紫草素对人滑膜成纤维细胞环氧化酶-2(COX-2)mRNA表达的影响,探讨紫草素可能的免疫抗炎作用机制。方法分离并培养人膝关节滑膜成纤维细胞,各加入IL-1β、TNF-α15 ng/mL,体外模拟人类风湿关节炎滑膜细胞。以塞来昔布作阳性对照,进行紫草素(浓度为5～80μg/L)干预,分别作用24、48、72 h后终止培养。用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达情况。结果紫草素对滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA的表达,对浓度无明显依赖性(P=0.089),用药时间上有显著统计学意义(P<0.0001)。塞来昔布抑制滑膜成纤维细胞COX-2mRNA水平的表达亦无明显浓度依赖性(P=0.051),而与用药时间显著相关(P<0.0001)。紫草素对滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达的影响与塞来昔布相比,其抑制作用无明显差异。结论紫草素可通过抑制COX-2 mRNA基因表达,减少炎症性细胞因子的产生而发挥其对类风湿关节炎的免疫抗炎作用,为开发紫草素成为COX-2抑制剂提供一定的实验基础。     

类风湿关节炎患者血清IL-6、TNF-α水平及其意义

目的 探讨类风湿关节炎（RA）患者血清中细胞因子水平及其临床意义。方法 应用双抗体夹心法检测36例RA患者血清自细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平。结果 RA患者血清IL-6、TNF-α水平均显著高于正常人（P〈0．01），且它们之间成正相关，并与ESR和CRP成正相关。结论 IL-6、TNF-α可能参与RA的发病及病理、免疫功能变化过程，IL-6、TNF-α水平检测有助于RA患者病情活动的判断及药物疗效的观察，可作为判断预后、指导治疗的指标。     

TNF-α激活NF-κB信号通路抑制培养成纤维细胞SDF-1α分泌

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活核因子-κB(NF-κB)信号通路对成纤维细胞生物学行为的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行体外培养,将细胞分为TNF-α组、TNF-α+吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)组及对照组,处理后的细胞采用CCK-8方法检测细胞增殖情况、Western blot和细胞免疫荧光检测IκBα蛋白表达与定位、ELISA检测基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的分泌。结果 TNF-α在一定浓度范围内对成纤维细胞起到明显的促增殖作用,CCK-8检测显示TNF-α组在不同浓度和不同时相点MEF的光密度值与TNF-α+PDTC组及对照组相比差异显著(P<0.05);免疫荧光染色显示IκBα主要分布于细胞质,TNF-α组与对照组和TNF-α+PDTC组相比,IκBα荧光强度明显减弱。Western blot结果发现TNF-α刺激后30 min,TNF-α组和TNF-α+PDTC组IκBα蛋白表达[(3 070.0±39.0)vs(1 421.7±75.3),(3 212.2±57.5)vs(1 468.2±45.8),P<0.05]均降至最低值,随时间推移逐渐恢复,TNF-α+PDTC组IκBα蛋白表达显著高于TNF-α组[(3 112.3±89.7)vs(2 610.4±26.9),P<0.05];ELISA检测发现TNF-α作用后成纤维细胞SDF-1α的分泌呈减少趋势[(15.9±1.6)vs(12.7±0.6),P<0.05],TNF-α+PDTC组则能显著逆转TNF-α作用[(23.5±3.2)vs(15.0±1.2),(21.6±0.4)vs(12.7±0.6),P<0.05],促进SDF-1α分泌。结论 TNF-α能通过激活NF-κB通路,影响小鼠胚胎成纤维细胞的增殖并抑制SDF-1α分泌。     

关节内注射不同浓度臭氧对类风湿关节炎大鼠TNF-α、TNFRⅠ和TNFRⅡ的影响

摘要：目的观察不同浓度臭氧(O3)对类风湿关节炎(RA)大鼠体内TNF-α、TNFRⅠ和TNFRⅡ的影响,阐述O3治疗类风湿
关节炎的机理。方法健康雄性Wistar大鼠48只,采用随机数字表法分为CON组、RA组、O2组、O3-10组、O3-20组、O3-30
组、O3-40组、O3-50组,每组6只。除空白对照组外,采用注射弗氏完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白的方法建立大鼠RA模
型。造模后21 d,根据分组关节内注射纯氧和浓度分别为10、20、30、40、50 μg/ml的O3各1 ml,每周1次,共注射3周。治
疗前后测量双后肢足爪厚度。治疗结束后1周,检测大鼠血清和滑膜TNF-α、TNFRⅠ和TNFRⅡ的含量。结果治疗结束
后,O3-40 组大鼠足爪厚度减小,与RA组相比差异有统计学意义（P<0.01）。RA组、O2组、及O3治疗各组血清中TNF-α、
TNFRⅠ、TNFRⅡ含量差异无统计学意义（P>0.05）。与RA组相比,O3-40组、O3-50组大鼠滑膜TNF-α、TNFⅡ含量降低,
差异有统计学意义（P<0.01）。与RA组相比,O3-40组大鼠滑膜TNFRⅠ含量升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论关
节内注射O3可减轻RA大鼠的关节肿胀,浓度为40 μg/ml的O3最为明显,作用机制和O3可以降低滑膜内TNF-α、TNFRⅡ
的活性,上调TNFRⅠ的表达有关。     

关节内注射不同浓度臭氧对类风湿关节炎大鼠TNF-α、TNFRⅠ和TNFRⅡ的影响

目的观察不同浓度臭氧(O3)对类风湿关节炎(RA)大鼠体内TNF-α、TNFRⅠ和TNFRⅡ的影响,阐述O3治疗类风湿关节炎的机理。方法健康雄性Wistar大鼠48只,采用随机数字表法分为CON组、RA组、O2组、O3-10组、O3-20组、O3-30组、O3-40组、O3-50组,每组6只。除空白对照组外,采用注射弗氏完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白的方法建立大鼠RA模型。造模后21d,根据分组关节内注射纯氧和浓度分别为10、20、30、40、50μg/ml的O3各1ml,每周1次,共注射3周。治疗前后测量双后肢足爪厚度。治疗结束后1周,检测大鼠血清和滑膜TNF-α、TNFRⅠ和TNFRⅡ的含量。结果治疗结束后,O3-40组大鼠足爪厚度减小,与RA组相比差异有统计学意义(P<0.01)。RA组、O2组、及O3治疗各组血清中TNF-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ含量差异无统计学意义(P>0.05)。与RA组相比,O3-40组、O3-50组大鼠滑膜TNF-α、TNFⅡ含量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与RA组相比,O3-40组大鼠滑膜TNFRⅠ含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论关节内注射O3可减轻RA大鼠的关节肿胀,浓度为40μg/ml的O3最为明显,作用机制和O3可以降低滑膜内TNF-α、TNFRⅡ的活性,上调TNFRⅠ的表达有关。     

RNA干扰对人环氧化酶-2合成以及对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞生物学活性的影响

目的分析siRNA对前列腺素E2（PGE2）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF—α）和血管内皮生长因子（VEGF）合成的影响。方法设计4条（1^#-4^#）环氧化酶-2（hCOX-2）mRNA的小分子干扰RNA（siRNA）,设立空白阴性（CTL）和1条随机序列（NC）对照。应用LipofectAMINE 2000将siRNA转染入滑膜成纤维细胞（RASF）,4h后,再加入100nmol/L的佛波酯。应用RT-PCR和Western印迹分别检测hCOX-2 mRNA和蛋白表达水平。采用ELISA法检测各组上清液中致炎因子水平。结果转染48h后,NC、1^#-4^#siRNA组与CTL组mRNA条带吸光度比值分别为0．72、0,3、0．25、0．4、0．04。转染36和48h后,各组与CTL组hCOX-2蛋白吸光度比值分别为1．04、0、52、0．39、0．9、0和1．05、0．52、0．51、0．9、0．15;4^# siRNA组上清液PGE2、IL-1β、TNF—α、IL-6和VEGF水平较其他各组为低,且与其他处理组相比死亡细胞率差异无统计学意义（P均〉0．05）。结论4^#iRNA组能有效抑制COX-2mRNA和蛋白表达,其上清液中致炎因子水平最低,死亡细胞较苴他各组无明显增加．