喹乙醇致肾脏毒性的内质网应激相关凋亡途径研究

目的通过喹乙醇染毒人源肾小管上皮细胞(HK-2细胞)并检测活性氧(ROS)和凋亡相关蛋白的表达,探讨喹乙醇肾脏毒性产生过程及其可能的内质网应激相关凋亡机制。方法分别以不同浓度(1、2、3、4、5、6、7和8μmol/ml)喹乙醇染毒HK-2细胞24 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖率以确定剂量-效应关系;Hoechst-33258荧光染色检测各组细胞凋亡形态,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率和细胞内活性氧含量;免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激相关凋亡蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、葡萄糖调节蛋白94(GRP94)和凋亡促进因子CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的表达。结果根据MTT毒性实验结果 ,喹乙醇对HK-2细胞凋亡效应的适宜剂量确定为1、2、3和4μmol/ml。在喹乙醇不同剂量观察组中,喹乙醇染毒2μmol/ml以上剂量组,细胞凋亡率、内质网凋亡相关蛋白GRP79、GRP94和CHOP表达增加,喹乙醇各染毒剂量均可见活性氧水平增加(P<0.05);在喹乙醇不同染毒时间观察组中,喹乙醇染毒12和24 h组,细胞凋亡率、内质网凋亡相关蛋白GRP79、GRP94表达增加,喹乙醇染毒6、12和24 h组,活性氧水平、内质网凋亡相关蛋白CHOP表达增加(P<0.05)。结论喹乙醇可致肾小管上皮细胞发生细胞凋亡从而造成肾脏毒性,凋亡的发生可能与内质网应激相关凋亡途径相关。     

PM_(2.5)通过氧化应激对人支气管上皮细胞JAK/STAT信号通路的影响

目的探讨PM2.5通过氧化应激对人支气管上皮细胞JAK/STAT信号通路和细胞因子的影响。方法利用传统侵入式方法培养支气管上皮细胞16HBE,本次研究共从两方面来进行探讨:(1)探讨PM2.5、氧化应激与JAK/STAT信号通路的关系,设立生理盐水对照组、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,5 mmol/L)组、50μg/ml PM2.5组、100μg/ml PM2.5组、50μg/ml PM2.5+5 mmol/L NAC组和100μg/ml PM2.5+5mmol/L NAC组,培养24 h后测定细胞内ROS水平和JAK2、STAT3的基因表达。(2)探讨PM2.5、JAK/STAT信号通路和细胞因子的关系,设立生理盐水对照组、6μmol/L AG490组、100μg/ml PM2.5组、6μmol/L AG490+100μg/ml PM2.5组,培养24 h后检测细胞上清液中白介素-6(IL-6)含量。结果染毒24 h后,50μg/ml PM2.5组和100μg/ml PM2.5组16HBE细胞内ROS水平和JAK2、STAT3基因表达均高于生理盐水对照组,PM2.5暴露+NAC保护组ROS水平和JAK2、STAT3的基因表达均低于各自PM2.5暴露组,差异均有统计学意义(P<0.05)。100μg/ml PM2.5组上清液中IL-6含量高于生理盐水对照组,6μmol/L AG490+100μg/ml PM2.5组细胞上清液中IL-6含量低于100μg/ml PM2.5暴露组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PM2.5能对支气管上皮细胞造成氧化损伤,并可能通过氧化应激调节上皮细胞JAK/STAT信号通路和相关细胞因子的产生。     

内质网应激在维生素E琥珀酸酯诱导的胃癌细胞凋亡和自噬中作用的研究

目的 明确内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)在维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate, VES)激活人胃癌MKN28细胞自噬和凋亡中发挥的作用。方法 体外培养人胃癌MKN28细胞,不同剂量(5,10,15,20μg/ml)VES处理细胞24小时后,Western blot检测ERS标志物GRP78,自噬标志物LC3、Beclin-1,凋亡相关蛋白Caspase-3和ERS凋亡通路关键信号分子CHOP的表达情况,流式细胞仪检测不同剂量组凋亡率。选择ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA),ERS激活剂衣霉素(Tunicamycin, TM)自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin, RAPA),设置对照组、4-PBA组(3 mmol/L)、TM组(5μg/ml)、VES组(20μg/ml)、VES+4-PBA组、RAPA组(100 nmol/L),检测GRP78、LC3、Beclin-1、Caspase-3和CHOP蛋白的表达情况,同时检测不同组细胞凋亡率或在电子显微镜下观察自噬体形态...     

CHOP通路在邻苯二甲酸单丁酯和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯联合暴露致小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用

目的探讨邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]染毒致体外培养的小鼠睾丸间质细胞(TM-3)凋亡过程中CHOP通路的作用。方法将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于0(对照)、50、100、200、400、800μmol/L的MBP和(或)MEHP溶液24、36、48 h后,采用CCK-8法测定细胞活性。将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于完全培养基(对照)、MBP(400μmol/L)、MEHP(400μmol/L)和MEHP(400μmol/L)+MBP(400μmol/L)溶液24 h后,电镜下观察小鼠睾丸间质细胞内质网超微结构的变化。将小鼠睾丸间质细胞分别暴露于完全培养基(对照)及200、400、800μmol/L MBP和(或)MEHP溶液24 h,流式细胞术检测细胞早期凋亡情况,免疫印迹法检测内质网应激标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CHOP的表达水平。结果与对照组相比,各浓度MBP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异有统计学意义(P0.05);且随着MBP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈上升趋势。随着MBP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率除100μmol/L组呈上升趋势外,其余浓度组均呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异具有统计学意义(P0.05);且随着MEHP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈上升趋势。随着MEHP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率在50μmol/L组呈上升趋势,在100μmol/L组呈先下降后上升的趋势,在400μmol/L组呈下降趋势,200μmol/L和800μmol/L组抑制率呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MBP+MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞的抑制率均较高,差异具有统计学意义(P0.05);且随着MBP+MEHP染毒浓度的升高,小鼠睾丸间质细胞的抑制率呈现上升趋势。随着MBP+MEHP染毒时间的延长,小鼠睾丸间质细胞的抑制率除200、400μmol/L组呈现逐渐上升趋势外,其余浓度组均呈先上升后下降的趋势。与对照组相比,各浓度MBP和(MEHP)染毒组TM-3细胞的早期凋亡细胞比例均较高,差异有统计学意义(P0.05);且随着染毒浓度的升高,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒小鼠睾丸间质细胞的早期凋亡细胞比例均呈现上升趋势。在同一染毒浓度下,睾丸间质细胞早期凋亡比例依次为MBP+MEHPMBPMEHP,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,各浓度MBP和(或)MEHP染毒组小鼠睾丸间质细胞内GRP78和CHOP蛋白的表达水平均增加,差异有统计学意义(P0.05);且随着染毒浓度的升高,MBP和(或)MEHP染毒小鼠睾丸间质细胞内GRP78和CHOP蛋白的表达水平均呈逐渐上升的趋势。结论 MBP和(或)MEHP染毒可致内质网损伤,上调GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达,这可能是MBP和(或)MEHP引起小鼠睾丸间质细胞凋亡的重要途径。     

微囊藻毒素-LR急性呼吸道暴露对小鼠生殖细胞凋亡的影响及其作用机制

目的探讨微囊藻毒素(MC-LR)急性呼吸道暴露对小鼠生殖细胞凋亡的影响及其作用机制。方法将30只健康8周龄SPF级ICR雄性小鼠按体重随机分为3组,分别为对照组和10、25μg/kg MC-LR组,每组10只。采取暴露式气管滴注法进行急性暴露36 h。检测小鼠睾丸组织凋亡情况以及睾丸组织内质网应激相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结果与对照组相比,各剂量MC-LR组小鼠睾丸组织阳性小管发生率和每管凋亡细胞数均较高,差异有统计学意义(P0.01);且随着MC-LR浓度的升高,阳性小管发生率和每管凋亡细胞数均呈上升趋势(P0.01)。与对照组相比,各剂量MC-LR组小鼠睾丸组织中caspase-3、caspase-12、CHOP蛋白及25μg/kg MC-LR组小鼠睾丸组织中GRP78蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05);而各剂量MC-LR组小鼠睾丸组织中caspase-9、IER1、PERK蛋白的表达水平均无明显改变。随着MC-LR染毒剂量的升高,小鼠睾丸组织中caspase-3、caspase-12、CHOP蛋白的表达水平均呈上升趋势。结论呼吸道急性暴露MC-LR可能通过内质网应激途径诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡,从而介导小鼠睾丸损伤。     

氧化苦参碱对亚砷酸钠致人肝细胞损伤的拮抗作用

目的探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OM)对亚砷酸钠致人胎肝(L-02)细胞株损伤的拮抗作用。方法将处于对数生长期的L-02细胞分别培养于0μmol/L亚砷酸钠(对照)、OM(200μg/ml)、亚砷酸钠(100μmol/L)及亚砷酸钠(100μmol/L)+OM(50、100、200μg/ml)的培养基中暴露18 h。检测细胞培养液中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平和细胞葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)蛋白的表达水平及细胞凋亡率。结果OM组与对照组各项指标差异均无统计学意义(P0.05)。与对照组及OM处理组比较,亚砷酸钠组细胞培养上清液中AST、ALT水平、细胞凋亡率、GRP78及CHOP蛋白表达水平显著升高(P0.05);而不同浓度OM干预后,上述指标均有不同程度下降(P0.05)。且随着OM干预浓度的升高,上述指标均呈下降趋势。结论砷可致L-02细胞损伤,OM可通过抑制L-02细胞内质网应激及减少肝细胞凋亡,从而发挥对肝细胞的保护作用。     

氟对小胶质细胞ROS和NO含量的影响

观察氟诱导活化后的小胶质细胞ROS和NO的生成状况,为进一步研究氟致中枢神经系统损伤机制提供实验依据。在细胞培养液中加入不同浓度(0、1、5、10、25、50μg/ml)的NaF,培养一定时间后检测小胶质细胞增殖活力、细胞内ROS及培养液NO含量。氟化钠能够增加细胞内ROS含量,50μg/ml NaF处理组,细胞内ROS含量与暴露时间正相关,1、5μg/ml NaF处理组,细胞内ROS含量与暴露时间负相关;BV-2细胞短时间暴露于氟化钠,细胞培养液NO含量与染氟剂量正相关,而随着暴露时间延长,细胞培养液NO含量随染氟剂量升高而降低;随着时间增加,每个NaF处理组NO含量均增加。小胶质细胞活化后导致细胞内ROS、培养液NO含量增加,且与时间、剂量相关。     

IRE1通路在高碘诱导甲状腺细胞凋亡中的作用

目的 观察IRE1通路在高碘诱导甲状腺细胞凋亡中的特征,进一步分析高碘诱导甲状腺细胞凋亡的作用机制.方法 用0(对照)、1、10、50 mmol/L的碘化钾(KI)染毒体外培养的Nthy-ori 3-1细胞,24h后采用流式细胞术检测Nthy-ori 3-1细胞凋亡率,用荧光定量PCR及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、肌醇需求酶-1(IRE1)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)基因蛋白的表达水平.结果 与0(对照)、l、10 mmol/L KI染毒组相比,50 mmol/L KI染毒组细胞凋亡率升高(P＜0.05);与对照组相比,各染毒组GRP78、IRE1 mRNA表达水平均无统计学差异(P＞0.05),CHOP mRNA表达水平升高(P＜0.05),GRP78、IRE1和CHOP蛋白表达差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 内质网应激中IRE1通路可能没有参与高碘诱导的Nthy-ori 3-1细胞凋亡过程.     

活性氧在氯化镉诱导的小鼠睾丸间质细胞凋亡中的作用

目的 探究活性氧(reactive oxygen species, ROS)在氯化镉(cadmium chloride, CdCl₂)诱导的睾丸间质细胞毒性中的潜在作用及机制。方法 以不同浓度CdCl₂(0、5和10μmol/L)染毒小鼠睾丸间质TM3细胞24 h。CCK-8法检测CdCl₂对TM3细胞活性的影响;Hoechst33342染色法检测凋亡小体;DCFH-DA探针法检测TM3细胞ROS水平;1 mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)预处理1 h后用10μmol/L CdCl₂染毒TM3细胞24 h, Western blot检测细胞内促凋亡蛋白Caspase-9和cleaved Caspase-3的表达水平;RT-qPCR检测细胞内抗凋亡基因Bcl-2以及促凋亡基因Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平。结果 CdCl₂染毒细胞24 h后,TM3细胞活力降低且凋亡小体数量增加。10μmol/L CdCl<...     

十溴联苯醚诱导小鼠海马神经元细胞氧化应激和凋亡的机制

目的探索十溴联苯醚(PBDE-209)诱导小鼠海马神经元细胞凋亡的潜在机制。方法原代海马神经元细胞和海马神经元细胞系HT-22用0、6.25、12.5、25、50和100μg/mL PBDE-209处理24 h。检测原代海马神经元细胞SOD活性,MDA、NO和GSH的含量,用Annexin V/PI双染法检测海马神经元细胞系HT-22细胞凋亡情况,用免疫蛋白印迹Western blot检测Bax、Bcl-2、CHOP、GRP78、PERK和Caspase-12蛋白表达水平。结果染毒组原代海马神经元细胞和HT-22细胞系细胞存活率显著降低(P0.05)。原代海马神经元细胞MDA、NO含量显著升高(P0.05),GSH含量、SOD活性显著降低(P0.05);原代海马神经元细胞的Bax/Bcl-2比值、CHOP、Caspase-12蛋白表达水平升高(P0.05)。HT-22细胞系GRP78、PERK、Caspase-12表达水平和细胞凋亡率升高(P0.05)。结论氧化应激和内质网应激可能参与PBDE-209诱导的海马神经元细胞凋亡过程。