不同冻存方法对大鼠脂肪来源干细胞生物学特性的影响

目的：研究不同冻存方法对脂肪来源干细胞（Adipose-derivedstemcells,ADSCs）生物学特性的影响。方法：体外分离培养SD大鼠腹股沟及附睾周围的脂肪组织，取第三代ADSCs冻存于液氮。实验分为三组：对照组A组为非冻存细胞，B组使用无血清非程序冻存液冻存细胞，C组使用传统冻存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）冻存细胞。12个月后复苏ADSCs，通过对比ADSCs的表面抗原、细胞凋亡、增殖及成骨分化情况，分析各组ADSCs生物学性能的差异。结果：各组细胞高表达CD29、CD90;A、B两组细胞的凋亡率显著低于C组（P<0.05）;B、C两组的增殖情况和A组相比，差异无统计学意义（P>0.05）,B组细胞的成骨分化能力要优于C组（P<0.05）。结论：无血清非程序冻存液冻存ADSCs的效果要优于传统冻存液。     

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。     

成人骨髓基质干细胞分化来源的肝细胞的冻存与复苏研究

目的在体外诱导人骨髓基质干细胞向肝细胞分化成熟的基础上,将细胞深冻保存,观察冻存复苏后细胞存活率及功能状况。方法在含有多种细胞因子的条件培养基中体外诱导成人骨髓基质干细胞,当细胞显示成熟肝细胞特征后,将细胞分别冻存于90%胎牛血清(FBS)和10%二甲亚砜(DMSO)(A组)、10%FBS、30%甘油和60%培养基(B组)和10%FBS、10%DMSO和80%威斯康星器官保存液(UW液)(C组)中。冻存4周后复苏细胞,测定各组细胞存活率及白蛋白合成情况。结果成人骨髓基质干细胞分化来源的肝细胞经冻存复苏后可恢复功能细胞形态,A、B和C组冻存液中细胞复苏后细胞存活率分别为(60·0±3·3)%、(91·0±2·6)%和(89·0±1·4)%,培养24h后检测上清液白蛋白浓度分别为(0·210±0·005)g/L、(0·340±0·020)g/L和(0·330±0·030)g/L。结论成人骨髓基质干细胞分化来源的肝细胞冻存复苏后仍保持较高的细胞存活率和功能,可作为临床肝细胞移植及生物人工肝的重要肝细胞来源。     

使用新型冻存保护剂进行人源脂肪组织冻存及移植的有效性评估

目的探索使用新型冻存剂进行人源脂肪组织冻存及移植的有效性。方法标本来源于2022年1至3月在北京大学第三医院成形外科进行吸脂术的健康成年女性, 将获得的脂肪组织离心后随机分为9组, 分别采用不同的冻存液[A组、B组、二甲基亚砜(DMSO)组]及冻存时长(1、2、3个月组)于液氮中冻存。A组冻存液组分为右旋糖苷40(DEX)+氨基酸+维生素+无机盐, B组冻存液组分为DMSO+DEX, DMSO组采用传统冻存液, 组分及配比为10% DMSO+20%胎牛血清(FBS)+70% DMEM-12。采用5 ml冻存管, 脂肪∶冻存液=3∶2, 每组冻存6管。脂肪组织复温后, 采用HE染色观察组织学形态, 采用免疫组化染色进行脂滴包被蛋白(Perilipin)定量分析, 通过阳性细胞数量与总细胞数量的比值计算Perilipin阳性率;采用CCK-8法测定脂肪细胞活性。选择健康无特定病原体级裸鼠38只, 根据移植脂肪使用不同的冻存保护剂(A组、B组、DMSO组)分为3组, 每组各12只, 另外2只作为day 0对照组, 各组脂肪冻存时间均为3个月。裸鼠腹腔麻醉后, 每侧背部注射复温后的冻存脂肪各0...     

小牛血清及维生素对小鼠生精上皮细胞冻存的影响

目的 :探讨维生素C(VC)、维生素E(VE)及小牛血清 (NBS)对冻存小鼠生精上皮细胞的影响。　方法 :在DMEM培养液 10 %二甲基亚砜 (DMSO)的基础上 ,分别添加 0～ 2 0 %NBS ,以及在DMEM培养液 10 %DMSO 10 %NBS的基础上 ,分别添加 15 0 μg/mlVC及 5 0 μg/mlVE,冷冻保存 7d龄小鼠生精上皮细胞 ,37℃水浴复苏 ,锥虫蓝染色检查细胞复苏率。　结果 :冻存液中分别含 0、5 %、10 %及 2 0 %NBS时 ,细胞复苏率分别为 83.4 %、84 .7%、85 .7%及 83.6 % ,各复苏率之间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。冻存液中分别含 15 0 μg/mlVC及 5 0 μg/mlVE时 ,细胞复苏率分别为 88.0 %及 82 .9% ,其复苏率与未加维生素的冻存液组 (85 .7% )相比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。　结论 :在冻存液中添加不同浓度的NBS及添加抗氧化剂VC或VE,对小鼠生精上皮单细胞冻存没有明显的保护作用 ,不能显著提高细胞复苏率     

不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同冻存液对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC）冻存复苏后生物学特性的影响,优化冻存方法。方法脐带取自2011年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院产科剖宫产的足月健康产妇。从脐带分离得到的hUC—MSC培养传代,取第3代细胞。根据冻存液不同分为3组,A组冻存液为二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）：胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）：低糖杜氏培养基（low glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium,LG—DMEM）为1：2：7,B组为DMSO：FBS：LG—DMEM为1：5：4,C组为DMSO：FBS为1：9,不含LG—DMEM。经冻存12个月,复苏细胞,以第3代未冻存细胞悬液作为对照组,采用台盼蓝染色法比较hUC—MSC的细胞存活率,采用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTF）法比较细胞的生长情况绘制生长曲线,倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用流式细胞仪检测各组细胞的表面标记。结果A、B、C三组的细胞存活率分别为（20±4）％、（71±8）％和（85±7）％。与C组比较,A组和B组的细胞存活率降低,差异有统计学意义（均为P〈0．05）。细胞生长曲线显示,与对照组相比,C组hUC—MSC在各时间点细胞生长迅速,但差异无统计学意义（P〉0．05）;B组hUC—MSC在24h、48h、72h细胞生长差异无统计学意义（P〉0．05）,在96h时间点生长速率低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;而A组hUC—MSC在各个时间点细胞生长减慢,差异有统计学意义（均为P〈0．05）。形态学观察显示,A组细胞胞体宽大多角,并且较多分支,B组和C组细胞饱满,折光性好,呈长梭形、纺锤形或多角形。A组细胞复苏后细胞数目过少无法进行表面标记,B组和C组hUC—MSC表面标记物CD31、CD34、CD45、人类白细胞抗原（HLA）-DR表达阴性,CD105、CD90、CIM4表达阳性。结论含高浓度血清的冻存液适合hUC—MSC的长期保存,含90％FBS的冻存液为hUC—MSC的最佳冻存保护液。     

不同冻存-解冻法处理小鼠皮肤组织对毛囊干细胞生长的影响

目的 观察皮肤组织经不同冻存-解冻法处理后,分离的毛囊干细胞的生长状况,寻找较好的组织冻存方案,为解决无法短期收集足量标本而不能有效获取毛囊干细胞的问题提供实验方法参考.方法 获取大鼠有两撮触须的上唇,经不同方法处理后,分离毛囊隆突部细胞.设立对照组:新鲜标本;实验组1:未加冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组2:4℃保存24 h;实验组3:1.4 moL/L.乙二醇作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组4:1.4 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;实验组5:1.4 tool/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存3个月;实验组6:0.7 mol/L DMSO作为冻存保护剂-70℃冻存24 h;冻存各组降温速率为0.5℃/min.其中3～6组分别采用单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法做对比.比较经以上6种方法处理后分离的毛囊隆突部细胞的活力和贴壁、增殖情况.结果 经冻存+单用培养基漂洗快速复苏法,4℃处理组获得的平均细胞活力为90.38%±4.62%,明显高于其他处理组(P值均＜0.05),仅次于对照组94.00%±5.64%.1.4moL/L DMSO作为冻存保护剂无论冻存24h或3个月均可取得较高的细胞活力(56.00%±3.91%和47.25%±3.55%),明显高于其他处理组(P值均＜0.05).组3～组6经单用培养基漂洗快速复苏法和蔗糖+培养基漂洗快速复苏法复苏所得平均细胞活力分别是25.63%±2.32%和27.25%±2.56%、56.00%±3.51%和54.88%±4.03%、47.25%±3.01%和44.00%±2.98%、27.88%±2.20%和26.75%±2.26%,差异均不显著(P值均＞0.05).各组毛囊干细胞生物学特性(贴壁、增殖等能力)与细胞活力呈相关趋势.结论 皮肤组织在4℃条件短期内可保持原代培养细胞的活力;皮肤组织以1.4 M DMSO为冻存剂-70℃条件下保存可较长时间保持细胞活力,较适合小鼠皮肤组织的保存,为毛囊干细胞的进一步研究提供技术支持.     

不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性比较

目的:比较不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性,找出适合作为种子细胞冻存的兔髓核细胞代次。方法:取3～4月龄新西兰大白兔10只,麻醉后在严格无菌条件下分离胸腰椎间盘(T1/2～L7/S1)髓核细胞,体外传代培养,分别取一、二、三、四、五代细胞冻存2～3个月后复苏,取一代未冻存细胞作为对照组(A组,n=10);一、二、三、四、五代冻存后复苏的细胞作为实验组(分别为B、C、D、E、F组,各组n=10),在相同条件下培养2周,培养第2天时采用台盼蓝染色测定细胞成活率;培养第2d、5d、10d、14d时采用MTT法检测细胞生长活性,采用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖(PG)含量;培养第14d时采用阿利新兰染色法测定糖胺聚糖(GAG)合成总量,用RT-PCR法检测各组细胞Ⅱ型胶原基因的表达情况。检测细胞浓度均为1×105个/ml。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。结果:培养第2d时B、C组细胞成活率接近A组(P>0.05);D、E、F三组细胞成活率明显低于A、B、C组(P<0.05)。不同时间点各组细胞均有不同程度的增殖,A、B、C、D四组生长趋势较接近,A、B、C三组相同时间点生长活性比较差异无统计学意义(P>0.05),D组与同一时间点A组比较有显著性差异(P<0.05),E组第10d和第14d以及F组各时间点间比较差异无显著性(P>0.05);A、B、C三组各时间点的PG含量及GAG含量高于相应时间点D、E、F组(P<0.05);A、B、C三组的Ⅱ型胶原基因表达量高于D、E组(P<0.05),明显高于F组(P<0.01)。结论:不同代次兔髓核细胞冻存后生物学特性不同,第一、二代细胞冻存后能较好保持髓核细胞特性,可作为种子细胞进行低温保存。     

不同培养基对皮肤来源的成纤维细胞增殖、衰老及胶原蛋白分泌的影响

目的:探讨不同培养基组成对皮肤成纤维细胞的增殖、衰老及胶原蛋白分泌的影响。方法:采用两步酶消化法从健康人耳后皮肤中获得成纤维细胞,依据培养基种类不同分为A组(FM无血清培养基)、B组(DMEM+10%FBS)、C组(RPMI-1640+10%FBS)、D组(DMEM+F12(1∶1)+10%FBS),采用MTT法、细胞划痕实验、酶联免疫吸附实验、β-半乳糖苷酶试验、软琼脂克隆形成试验比较不同培养基对细胞增殖、迁移、胶原分泌、老化、变异的影响。结果:采用酶消化法在2d~4d内即可从组织块中获得大量成纤维细胞;其中B、D组较A、C组细胞增殖较快,且趋势与MTT细胞增殖相同;划痕实验显示B、D组较A、C组向缺损部位迁移更为明显;此外,D组胶原蛋白分泌量高于其余三组(P0.05),且连续传代30次后,细胞无明显衰老及瘤变迹象。结论:两步酶消化法可快速高效的从人组织块中获得成纤维细胞,且采用DMEM+F12(1∶1)完全培养基有利于促进细胞增殖、分泌胶原蛋白及延缓细胞衰老。     

人耳软骨细胞冻存复苏后的体外成软骨能力及体内转归的研究

目的以无支架软骨膜片为模型,研究冻存对人耳软骨细胞的细胞活力、增殖和体外/体内软骨再生能力的影响。方法将小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨,以胶原酶消化、分离,得到原代软骨细胞。将软骨细胞扩增至第1代(P1)后,分为实验组及对照组。实验组(Exp)以含有FBS和DMSO的冻存液,经程控降温仪和液氮冻存1个月后复苏,高密度接种,制备软骨膜片及可注射软骨;对照组(Ctrl)不经冻存继续扩增至第3代(P3),高密度接种,制备软骨膜片及可注射软骨。通过光学显微镜、CCK-8、活/死细胞染色、HE和阿利新蓝染色等,检测细胞形态、活力、增殖能力及软骨特异基质(ECM)的表达能力。通过每组体外软骨膜片的湿重、体积及生化成分定量检测,确定软骨细胞的体外成软骨能力。将每组软骨膜片制成新生软骨颗粒(可注射软骨),注射至裸鼠皮下(n=5),8周后取材,行大体观察、HE染色和生化成分定量检测,比较每组软骨细胞的体内成软骨能力。结果两组细胞的形态、活力、增殖能力和软骨特异的糖胺聚糖(GAG)形成能力无明显差异。相比对照组,实验组体外再生软骨的湿重及总胶原表达升高;但体内软骨再生能力两组亦无明显差异。结论细胞冻存复苏对人耳软骨细胞的细胞活力、增殖和体外/体内软骨再生能力无明显影响。     

未成熟大鼠睾丸组织玻璃化冻存效果的比较性研究

目的采用三种浓度冷冻保护剂方案对两周龄未成熟大鼠睾丸组织进行玻璃化冻存,并对冻存效果做出评价。方法根据DMEM/F12培养基中所含二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)的浓度差异,将冻存液分为A、B、C三组,其中DMSO和EG的浓度依次为7.5%、15%、25%。将大鼠睾丸分割为8mm3～9mm3大小的组织块,分别纳入对照组、A组、B组和C组中。对照组的睾丸组织不作冷冻处理,直接进行后续实验;A、B、C三组使用不同浓度的冷冻保护剂进行玻璃化冷冻。冻存2周后,取出样本进行复苏。比较各组睾丸组织的形态学改变,采用免疫荧光染色观察精原细胞标志物UCHL1、支持细胞标志物SOX9、睾丸间质Leydig细胞标志物StAR和细胞增殖核抗原PCNA表达的改变,观察细胞的凋亡情况。结果玻璃化冻存后,未成熟大鼠睾丸组织形态发生一定程度改变,生精细胞及支持细胞标志物表达下降,凋亡增加,与对照组比较均有显著性差异(P0.05)。三个冻存组中,B组形态学改变最小,细胞标志物表达水平与对照组相差最少,凋亡最少;A组的结构损伤明显,生精上皮与基底膜分离;C组的细胞标志物表达显著下降,凋亡增加最显著。结论冷冻保护剂浓度变化对未成熟睾丸组织玻璃化冻存效果有显著影响,15%DMSO和15%EG组合是玻璃化冻存未成熟大鼠睾丸组织较适宜的冷冻保护剂浓度方案,可为进一步的临床应用提供参考。     

破骨细胞的传代、冻存与复苏

目的:探讨破骨细胞传代、冻存与复苏的可行性,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法。方法:破骨细胞的传代:取成年SPF级雄性SD大鼠1只,体重250 g,腹主动脉采血,分离周围血单个核细胞,经RANKL、M-CSF诱导培养2周,形成多核破骨细胞后,采用胰蛋白酶消化、震荡、吹打法,制成细胞悬液,离心后用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔培养板与直径35 mm培养皿中。破骨细胞的冻存:取上述细胞悬液,离心后用DMSO、FBS、α-MEM(1∶2∶7)冻存液,按常规程序将细胞冻存于-196℃液氮中。破骨细胞的复苏:从液氮中取出冻存的破骨细胞,37℃水浴中快速解冻,加PBS离心清洗后,用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔细胞培养板与直径35 mm培养皿中。同时对传代与复苏培养中破骨细胞的消化与贴壁过程,采用倒置相差显微镜与活细胞工作站进行观察记录与动态成像,3 d后作TRAP染色。结果:破骨细胞经胰蛋白酶消化、震荡、吹打后,细胞基本上脱壁、悬浮,可以制成细胞悬液,用于传代与冻存。破骨细胞传代培养后,大多在2 h内开始贴壁,贴壁后胞内细胞核清晰可见。经液氮冻存的破骨细胞,复苏培养后2~3 h开始贴壁,胞质展开,可见多个细胞核。传代与冻存复苏培养后的破骨细胞,TRAP染色呈阳性反应。结论:破骨细胞虽然贴壁比较牢固,但经适当的消化、震荡及吹打,多数可脱壁悬浮,并能实现传代培养,同时还可采用常规方法进行细胞冻存与复苏培养,经传代与冻存的破骨细胞仍可保持破骨细胞的活性。破骨细胞的传代与冻存,可以按实验计划与用量需求,随时进行分量传代与复苏培养,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法。     

一步法联合冻存提高大鼠胰岛冻存质量的研究

目的探讨提高大鼠胰岛冻存质量的方法,以期为建立胰岛库奠定基础。方法将受体鼠分为实验组A组:即一步法联合冻存的胰岛移植组;对照组B组:新鲜的胰岛移植组;对照组C组:逐步法冻存的胰岛移植组。观察3组之间胰岛收获率,活性及移植后效果等方面的差异。结果纯化后收获大鼠胰岛每只(826.87±93.24)IEQ。A组平均胰岛收获率为(87±4)%,高于C组的胰岛收获率(81±4)%。A组和C组经过胰岛刺激素释放实验后均有较B组高的基础胰岛素释放量,但刺激指数则明显低于B组的637.3±39.5。胰岛移植入糖尿病鼠受体后,A组和B组在移植后1周即恢复血糖为正常值,并维持到观察结束。而C组中则需要较长时间纠正血糖到正常。移植(2011.14±114.22)IEQ胰岛在A组和B组可达到100%纠正糖尿病。结论采用全新的细胞内低温保存液(HTS)结合细胞冻存液(DMSO)对大鼠胰岛进行一步法冻存取得了明显优于用DMSO逐步冻存的效果。     

低温冻存对胚胎大鼠神经干细胞生物学特性的影响

目的 研究不同冻存液对胚胎大鼠神经干细胞的保护作用及低温冻存对神经干细胞增殖及分化潜能的影响。方法 分别应用冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ对源于胚胎大鼠的神经干细胞球进行冷冻,于复苏后进行传代培养,并鉴定其增殖和分化能力。结果 复苏后的神经干细胞可以多次传代,冻存神经干细胞的克隆增殖率为(36.80±3.81)％,未冻存者为(38.15±4.80)％,两者相比差异无显著性(P>0.05)。冻存液Ⅰ和冻存液Ⅱ保存的神经干细胞分化为神经元的比例分别为(7.61±0.74)％和(12.76±2.53)％(P>0.05);分化为少突胶质细胞的比例分别为(0.90±0.50)％和(2.18±0.33)％(P>0.05);分化为星形细胞的比例为(47.67±2.10)％和(35.38±3.14)％(P<0.05)。结论 冻存的胚胎大鼠神经干细胞复苏后仍具有活跃的增殖和分化潜能,含10％血清的冻存液可以促使神经干细胞向星形细胞方向转化。     

脐血来源未成熟树突状细胞低温冻存的实验研究

目的观察脐血来源的未成熟树突状细胞(imDC)低温冻存前后的生物学特性,探讨imDC的保存方法。方法取新鲜脐血分离单个核细胞(MNC),在体外经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素(rhIL)4诱导产生imDC后,加入二甲亚砜(DMSO)作为保护剂,-80℃降温,-196℃保存,40℃水浴复温,获得冻存imDC。光学显微镜下观察冻存的imDC与新鲜imDC形态,计算其锥虫蓝拒染回收率(TBR);流式细胞仪检测细胞表面成熟标志;混合淋巴细胞反应(MLR)检测细胞刺激未致敏T淋巴细胞的增殖能力。结果脐血MNC在rhGM-CSF和rhIL-4诱导下可向树突状细胞(DC)分化,相差显微镜显示细胞形态不规则,细胞表面呈树枝样突起;扫描电镜显示,细胞表面不规则,有树枝样突起和不规则皱褶。冻存imDC复苏后TBR为(86．8±1．3)％,冻存imDC在形态上与新鲜imDC无明显差异。MNC体外经rhGM-CSF和rhIL-4诱导生成的imDC表面CD1a阳性率为(62±8)％、CD14为(18±7)％、人类白细胞DR抗原(HLA-DR)为(67±5)％、CD80为(13±7)％、CD86为(12±5)％;反映DC成熟的表面标志物CD83为(4．6±2．0)％,符合imDC的表型特征。冻存imDC的CD80、CD86、CD83分别为(15±5)％、(17±5)％、(7．4±3．3)％,较新鲜imDC有所增高(P<0．05),但仍符合imDC的表型特征。对照组MLR的每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值为(488±197)min-1;新鲜imDC组为(463±104)min-1,与冻存imDC组的cpm值(512±78)min-1比较,差异无统计学意义(P>0．05)。各组细胞刺激指数(SI)均<2。新鲜imDC和冻存imDC均不能有效刺激同种未致敏T淋巴细胞增殖。结论本实验中获得的冻存imDC具有足够的细胞活力,其细胞免疫表型和细胞功能具有不成熟特征,说明利用DMSO低温保存imDC的方法可行。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞冻存后的生物学特性

目的 明确冻存对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓间充质干细胞(MSC)生物学特性的影响.方法 采用细胞贴壁法获取CML患者骨髓MSC,将传代后的细胞用IMDM细胞冻存液(含质量分数为10%的二甲基亚砜和400 g/L的胎牛血清)保存在-196℃液氮中.观察短期(4周)和长期(12个月)冻存复苏后MsC的增殖能力.将冻存后CML患者骨髓MSC作为滋养层,应用甲基纤维素半固体培养,检测其支持造血的能力.混合淋巴细胞反应检测冻存后CML患者的骨髓MSC免疫抑制能力.结果 短、长期冻存后的MSC的细胞活性分别为为(94.1±1.9)%和(89.8±4.3)%;短、长期冻存后细胞的增殖能力与冻存前MSC相似;冻存后CML患者的骨髓MSC仍具有支持造血集落生长作用(CFU-GM,CFU-E,CFU-GEMM)和抑制T淋巴细胞增殖能力,与冻存前相比,没有明显差别.结论 冻存可以降低CML患者骨髓MSC的细胞活性,但是并不影响MSC的增殖、支持造血和免疫调节的能力.     

骨髓基质干细胞-80℃保存的初步研究

目的:探索适合于人骨髓基质干细胞-80℃冷冻保存的条件和方法。方法:体外分离培养人骨髓基质干细胞,以含不同浓度二甲亚砜的冻存液和不同细胞浓度-80℃深低温保存。3个月后复苏接种培养,观察细胞形态、存活率和贴壁率;通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验比较细胞分裂增殖能力;3H-脯氨酸(3H-Proline)掺入实验检测胶原合成能力;RT-PCR法检测Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达。结果:不同二甲亚砜浓度保存骨髓基质干细胞复苏后的细胞形态和功能有所不同,其中含5%二甲亚砜冻存液组保存效果最差,15%组最佳。15%二甲亚砜冻存液组复苏后骨髓基质干细胞的形态与未冻存组相似,存活率为(85%±3%),贴壁率为(81%±5%)。骨髓基质干细胞保持较强的分裂增殖和胶原合成能力,Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达与5%或10%二甲亚砜冻存液组比较有统计学差异(P<0.05)。冻存骨髓基质干细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组。结论:含15%二甲亚砜的冻存液适合于骨髓基质干细胞长期保存,高浓度组骨髓基质干细胞冻存效果优于低浓度组。     

冻存对人脐血间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察冻存复苏对人脐血（human umbili calcord blood）间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）生物学特性的影响。方法体外分离、培养人脐血MSCs，传代后，将第3代的MSCs加入含10％二甲基亚砜（DMSO）和90％胎牛血清的细胞冻存液中，-196℃液氮保存4周，观察比较冻存前及冻存复苏后MSCs的形态、增殖及多向分化能力。结果冻存前及冻存复苏后，MSCs形态无明显差别，均呈典型的梭形，MSCs贴壁生长；MSCs生长曲线相似，冻存复苏后的细胞生长曲线略有下降，但差异无统计学意义（P〉0．05）；MSCs经脂肪诱导液诱导2周后，细胞浆中出现脂肪细胞所特有的脂肪滴，经0．5％油红0染色，脂肪滴染为红色，说明MSCs有向脂肪细胞分化的能力；Mscs经成骨诱导液诱导4周后，VonKossa染色可见黑色的矿化结节沉积，钙结节的形成为成骨细胞特有，说明Mscs有向成骨细胞分化的能力。提示冻存复苏后Mscs经诱导仍然可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，与冻存前无明显差异。结论人脐血MSCs经冻存复苏后，其生物学特性可获良好保持。     

不同冻存时间对脂肪组织生物学活性的影响

目的:探讨在-80℃低温条件下冻存不同时间的脂肪组织颗粒的结构及生物学活性变化。方法:将吸脂后的脂肪经过洗涤、离心后低温保存,1周、4周、8周、12周、16周、20周、24周后,对复温后的脂肪组织颗粒进行大体观察、组织学观察、活性检测、SVF细胞培养等。结果:随冻存时间的延长,脂肪组织的结构及生物学活性逐步下降,冻存1周的脂肪组织活细胞面积(35.35±4.05)%较新鲜脂肪(79.25±7.44)%显著减少,差异有统计学意义(P0.01),冻存1周的脂肪细胞较新鲜脂肪细胞线粒体活性显著下降(P0.01),SVF细胞培养,冻存脂肪来源的贴壁细胞数量较新鲜脂肪显著减少(P0.01),且细胞生长缓慢、状态较差。结论:大多数脂肪细胞在一次冷冻保存过程中便失活,而冻存时间的延长与脂肪细胞活性降低的相关性并不明显,不推荐临床使用不添加保护剂直接冻存的脂肪进行移植。     

提高冻存胚胎胰岛移植效果的实验研究

目的探讨三维组织细胞旋转培养系统(RCCS)对胚胎胰岛冻存复苏后质量的影响。方法将胚胎胰岛平均分为3组,实验组1、2为胚胎胰岛冻存前后分别用RCCS培养和普通培养,对照组新鲜胰岛经RCCS培养。切取胚胎胰腺,胶原酶V消化,纯化。然后进行标准冻存步骤,复苏后继续培养。并检测各组胰岛数量、活性、胰岛素刺激实验结果。结果纯化后收获胰岛最多每个胚胎5012.73IEQ,最少2432.68IEQ,平均(3548.07±273.46)IEQ。微重力培养组胰岛细胞存活率、胰岛素释放量、胰岛素刺激指数等均高于普通培养组。移植经过微重力培养的(2000±1)%IEQ新鲜胚胎胰岛或冻存胚胎胰岛在移植后1周内可达100%纠正糖尿病。结论微重力旋转培养有利于胰岛细胞的生长繁殖,使胰岛具有更好的胰岛素分泌能力,该方法同胰岛冻存相结合,可以进一步提高胰岛的冻存效果,为胰岛库的成功建立探索出一条新的途径。