PrLZ基因3′-UTR区荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

目的分析前列腺亮氨酸拉链(PrLZ)基因3′非编码区(3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,为研究PrLZ基因转录后的miRNA调控提供有效的工具。方法使用PCR方法从PrLZ阳性的C4-2细胞中扩增含PrLZ基因3′-UTR区序列,插入到T-Vector载体上,提高PCR产物的连接、克隆效率,通过Xbal和BamHI限制性内切酶双酶切后将其连入经相同内切酶双酶切后的荧光素酶报告基因载体pLUC中,构建pLUC-PrLZ 3′-UTR载体,使用生物信息学方法预测PrLZ基因3′-UTR可能是miR-34a的作用靶点,使用慢病毒载体构建对照载体(质粒名称-NC)和过表达miR-34a(质粒名称-miR-34a),包装成病毒颗粒后分别感染293-T细胞,然后通过X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂将pLUC空质粒和pLUC-PrLZ 3′-UTR重组质粒分别转染293-T细胞,Promega试剂盒测定荧光素酶的活性。结果得到含PrLZ基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证了其序列的正确性。在miR-34a高表达组的293-T细胞中,重组质粒组荧光素酶活性比空质粒组低40%,差异具有统计学意义(P0.05)。结论成功构建PrLZ基因3′-UTR荧光素酶报告载体,miR-34a可以显著降低荧光素酶的活性,PrLZ基因3′-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点。     

TMEM33 mRNA 3′-UTR报告基因载体的构建及功能验证

目的:根据microRNA-146a(miR-146a)预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒并进行功能验证,为研究吸入性损伤中miR-146a通过靶向跨膜蛋白33(TMEM33)对Toll样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路的调控作用提供前期的工作基础。方法:通过生物学软件预测TMEM33mRNA 3′端非翻译区(TMEM33mRNA 3′-UTR)可能是miR-146a的作用靶点,将设计合成的TMEM33及其突变序列TMEM33-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒,采用脂质体法将这两种重组荧光素酶报告质粒pMIR-TMEM33和pMIR-TMEM33-mu分别与miR146amimics共转染HEK-293T细胞,以pMIR-TMEM33+miR-control转染HEK-293细胞作对照,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:TargetScan和miRanda软件预测显示,miR-146a与TMEM33mRNA 3′-UTR存在互补结合位点,构建的荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测系统显示,miR-146a对TMEM33mRNA 3′-UTR具有靶向作用,pMIR-TMEM33+miR146amimics组较pMIR-TMEM33+miR-control组荧光素酶活性降低62%左右,差异具有统计学意义(P<0.01);而miR-146a对TMEM33-mu 3′-UTR无靶向作用,pMIR-TMEM33-mu+miR-146a组与pMIR-TMEM33+miR-control组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建TMEM33mRNA 3′-UTR荧光素酶报告载体,证实miR-146a对TMEM33mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为从基因水平深入揭示吸入性肺损伤发病机制提供实验室数据和方法。     

Speedy A蛋白调控相关miRNA的筛选及miR-23b靶标的验证

目的筛选和鉴定调控Speedy A蛋白表达的miRNAs。方法通过在线数据库TargetScan、miRNA和miRwalk预测与Speedy A相互作用的miRNAs,并结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库,筛选出评分较高的候选miRNAs。实时定量PCR检测小鼠7、14、21、35、64d睾丸中候选miRNAs和Speedy A基因的表达,筛选出表达趋势呈显著负相关的miRNAs。构建野生型Speedy A基因3’端非翻译区荧光素酶报告基因载体(WT-Speedy A-3’UTR)及miR-23b靶序列突变型载体(mut-Speedy A-3’UTR),分四组转染HEK-293T细胞株:野生型实验组,WT-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23bmimic;野生型对照组,WT-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23b mimic NC;突变型实验组,mut-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23bmimic;突变型对照组:mut-Speedy A-3’UTR质粒+miR-23bmimic NC,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果通过生物信息学方法结合本实验室前期建立的精原细胞和精母细胞小RNA数据库筛选出4个评分较高的miRNA:miR-23b、miR-143、miR-345-3p和miR-881。实时荧光定量PCR检测不同发育时期小鼠睾丸中以上4种miRNAs和Speedy A基因的表达水平,结果显示在不同发育时期的小鼠睾丸中,miR-23b的表达趋势与Speedy A呈显著负相关(P0.01)。成功构建了重组野生型/突变型(WT/mut)Speedy A3’-UTR载体,通过双荧光素酶报告基因检测显示野生型实验组相比对照组吸光值明显降低,差异有统计学意义(P0.01)。结论野生型实验组对其它3组对照组荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-23b能够靶向调控Speedy A基因的表达。     

microRNA-449a靶向Notch1抑制膀胱癌细胞J82的迁移

【摘要】〓目的〓研究microRNA-449a(miR-449a)对膀胱癌细胞J82迁移能力的影响以及对靶基因Notch1表达的影响。方法〓通过mimics转染膀胱癌细胞株J82使其过表达miR-449a,利用Transwell实验、细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化;采用实时定量PCR和蛋白印迹检测细胞Notch1表达水平的变化,并通过荧光素酶实验验证miR-449a与Notch1基因的直接调控关系。结果〓与对照组相比,转染miR-449a组的J82细胞的迁移能力减弱。过表达miR-449a后,J82细胞Notch1的mRNA表达无明显变化(P=0.5739),但Notch1蛋白表达下调(P=0.0135)。荧光素酶报告基因实验显示,miR-449a能明显抑制Notch1-3’UTR的荧光素酶活性(P=0.0016)。结论〓过表达miR-449a可能通过靶向降低Notch1基因的蛋白表达,抑制膀胱癌细胞的迁移。     

含Survivin启动子条件复制型腺病毒的构建及其对前列腺癌抑瘤效应的体外研究

目的：构建携带有Survivin启动子和报告基因的条件复制型腺病毒并观察该病毒对前列腺癌细胞的特异性溶瘤作用。方法：以前列腺癌细胞系LNCaP细胞全基因组DAN为模板,PCR扩增Survivin启动子,构建pGL3BSurvivin质粒表达载体,荧光素酶检测系统观察前列腺癌细胞中Survivin启动子活性。将pGL3BSurvivin亚克隆至穿梭质粒pShuttle中,构建含有Survivin启动子的重组腺病毒reADGL3BSurvivin。转染HEK293细胞进行重组病毒的扩增、纯化和滴度检测。利用CCK-8法检测重组腺病毒对前列腺癌细胞的生长抑制作用,以正常前列腺细胞为对照。结果：经多种限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定,证实成功构建了含Survivin启动于报告基因质粒表达载体。荧光素酶报告基因检测结果表明前列腺癌细胞内Survivin启动子活性明显高于正常细胞组。同时也证实成功构建了含Survivin启动子和报告基因的腺病毒载体;CCK-8结果显示reADGL3BSurvivin可有效抑制前列腺癌细胞增殖而对正常细胞无增殖抑制作用。结论：成功构建含Survivin启动子的条件复制型腺病毒具有选择性杀伤前列腺癌细胞的能力,实验结果为前列腺癌靶向治疗提供了良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略。     

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体,为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术,将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下乒乓转染GP+E86和PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。扩大培养,测定病毒滴度,并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定,载体插入基因大小、位置均正确,并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系,该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN,为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。     

长链非编码RNA牛磺酸上调基因靶向作用于微小RNA-145对甲状腺癌细胞侵袭的影响及其机制

目的观察甲状腺乳头状癌(PTC)细胞中长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因(TUG1)靶向作用于微小RNA(microRNA,miR)-145/锌指E-盒结合同源异形盒-1(ZEB1)对细胞侵袭能力的影响。方法实验标本选自2018年4月至2019年12月间河北医科大学第二医院甲状腺乳腺外科收集的甲状腺乳头状癌及癌旁标本共30例,采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法观察乳头状甲状腺癌及其癌旁组织中lncRNA TUG1及miR-145的表达水平;将lncRNA TUG1 shRNA和miR-145 mimics分别转染到甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中,利用Transwell细胞侵袭实验观察lncRNA TUG1和miR-145对甲状腺癌细胞侵袭能力的影响。应用生物信息学及双荧光素酶报告基因分析lncRNA TUG1和miR-145的关系及miR-145的靶基因。同时,利用蛋白质印迹法(Western blot)实验检测lncRNA TUG1和miR-145对靶蛋白表达水平的影响。两组间统计学差异通过双尾t检验进行分析。结果实时荧光定量PCR实验结果显示,lncRNA TUG1在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平(4.43±0.07)高于癌旁组织(1.13±0.06),差异有统计学意义(t=3.124,P<0.05),miR-145的表达水平(0.39±0.08)低于癌旁组织(1.08±0.04),差异有统计学意义(t=2.937,P<0.05);甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中转染lncRNA TUG1 shRNA组及miR-145 mimics组侵袭细胞数[(292.4±48.2)、(234.2±42.4)个]低于各自对照组侵袭细胞数[(452.9±50.8)、(439.4±39.8)个],差异有统计学意义(t=3.205,P<0.05;t=3.186,P<0.05);生物信息学及双荧光素酶报告基因分析结果显示,lncRNA TUG1可以与miR-145互补结合,ZEB1是miR-145的靶基因;lncRNA TUG1 shRNA组细胞ZEB1蛋白表达水平(0.33±0.12)低于lncRNA对照组细胞中ZEB1蛋白表达水平(1.17±0.12),差异有统计学意义(t=3.320,P<0.05),miR-145 mimics转染组细胞蛋白表达水平(0.46±0.11)低于miRNA对照组细胞中ZEB1蛋白表达水平(1.05±0.12),差异有统计学意义(t=3.450,P<0.05)。结论lncRNA TUG1能够靶向作用于miR-145/ZEB1调控甲状腺癌细胞的侵袭能力。     

斑马鱼notch1a对pka报告基因转录调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因研究斑马鱼notch1a对pka的转录调控作用。方法利用NCBI数据库获得斑马鱼notch1a基因序列,克隆notch1a基因的胞内段NICD(Notch intracellular domain),构建pCMV-N1aICD表达载体,利用蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白的表达水平;利用加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器数据库获得斑马鱼pka基因的启动子序列,构建pGL3-pka报告基因载体,然后在HEK293T细胞系中证实构建的报告基因载体具有活性;将重组荧光素酶报告载体和N1aICD表达载体共转染HEK293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证notch1a胞内段对pka基因转录水平的调控作用。结果经测序验证克隆成功后,蛋白质印迹法检测N1aICD蛋白能够正常表达,且蛋白大小与预测结果一致。双荧光素酶报告基因显示,pGL3-pka组活性为pGL3空载组的3.25倍。转染pGL3-pka和pCMV-N1aICD组活性为转染pGL3-pka和pCMV空载对照组的0.31倍。结论斑马鱼notch1a对pka启动子具有转录抑制作用。在骨形成和骨重建中,Notch通路可能通过调控pka来参与成骨与破骨细胞的分化。     

长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因22靶向作用于微小RNA-27a-3p/胰岛素样生长因子-1信号轴对三阴性乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的观察三阴性乳腺癌细胞中长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因22(SNHG22)靶向作用于微小RNA(miR)-27a-3p/胰岛素样生长因子-1对细胞侵袭能力的影响。方法选取2019年6月至2022年3月河北医科大学第二医院甲状腺乳腺外科收治30例三阴性乳腺癌及其癌旁组织标本作为研究对象, 采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析癌及癌旁组织中SNHG22和miR-27a-3p的表达变化;将SNHG22过表达质粒和miR-27a-3p模拟物(mimics)分别转染至三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中, 利用细胞侵袭实验观察两者对细胞侵袭能力的影响;利用生物信息学软件及双荧光素酶报告基因分析SNHG22和miR-27a-3p的关系及miR-27a-3p的下游靶基因。将miR-27a-3p mimics、miRNA阴性对照(miR-NC)分别与SNHG22共转染后, 观察上调miR-27a-3p表达对过表达SNHG22的MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响。两组间比较采用t检验。结果荧光定量PCR实验结果显示, SNHG22在三阴性乳腺癌组织中的表达水平(3.184±1.800)明...     

hsa_circ_0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路促进前列腺癌进展

目的:研究hsa_circ_0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路调控前列腺癌的进展的分子机制。方法:核质分离检测hsa_circ_0005221和miR-339-5p在细胞中的表达定位;Pulldown检测hsa_circ_0005221结合的miRNA;软件预测结合荧光素酶报告基因确定与hsa_circ_0005221结合的RNA是miR-339-5p;定量PCR检测hsa_circ_0005221在前列腺上皮细胞和前列腺癌细胞的表达量;在前列腺癌细胞分别转染hsa_circ_0005221过表达质粒和siRNA测DU145和LNCaP增殖、侵袭和迁移能力及上皮间质转化(EMT)和凋亡水平;在敲低hsa_circ_0005221基础上,转染miR-339-5P mimics和inhibitor测DU145和LNCaP增殖、侵袭和迁移能力及EMT标志性蛋白、STAT5A和凋亡水平。结果:hsa_circ_0005221在前列腺癌细胞的表达水平明显高于前列腺上皮细胞。核质分离实验表明hsa_circ_0005221、miR-339-5P均主要在胞质中表达。在DU145和LNCaP敲低hsa_circ_0005221,其增殖、侵袭、迁移及EMT能力明显下降;凋亡水平增加。过表达hsa_circ_0005221则结果相反。在软件预测排名前5的miRNA中,Pulldown实验结果显示与hsa_circ_0005221结合的有miR-339-5P、miR-17、miR-520H;敲低或过表达hsa_circ_0005221,miR-339-5P变化最明显。荧光素酶报告基因结果显示hsa_circ_0005221与miR-339-5P结合。在DU145和LNCaP敲低hsa_circ_0005221基础上转染miR-339-5P mimics,其增殖、侵袭和迁移能力明显下降,凋亡水平增加,E-cad水平增加,N-cad水平下降,STAT5A表达水平增加。敲低hsa_circ_0005221基础上上转染miR-339-5P mimics则结果相反。结论:hsa_circ_0005221通过miR-339-5p/STAT5A通路促进前列腺癌的进展。     

E-box元件在p21基因表达调控中作用的研究

目的：通过p21基因调控序列E-box位点的突变分析，研究E-box位点对p21基因表达调控的作用。方法：将人野生型p21基因启动子全长序列构建到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic，并进一步对重组载体pGL3-p21p启动子E-box位点做定点突变，构建突变载体E1、E2、E3，分别转染人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304细胞），DLR系统测定荧光素酶活性，并观察E-box位点突变前后荧光素酶活性变化。结果：测序结果表明野生型pGL3-p21p及突变载体E1、E2、E3构建成功。野生型pGL3-p21p荧光素酶活性（105.82±16.55）明显高于空载体pGL3-basic（1.56±0.62）；突变载体E1、E2、E3的荧光素酶活性（70.71±16.46、37.87±3.26、83.25±11.48）较野生型载体不同程度下降（P〈0.01）。结论：p21基因启动子某些E-box位点参与了p21基因的表达调控。     

葛根素对成骨细胞中miRNA-204的调控及其与Runx2基因表达的关系

目的研究葛根素作用于成骨细胞MC3T3-E1后miRNA表达的变化以及与Runx2基因表达的关系。方法 RT-PCR和western blot法检测Runx2的mRNA表达水平和蛋白表达水平;miRNA表达谱检测葛根素作用于成骨细胞后可能靶向Runx2的miRNA;Target Scan、Pic Tar等靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA;RT-PCR测定miRNA-204表达量;构建Runx23’UTR/突变型Runx2 3’UTR重组质粒、合成miRNA-204mimics和miRNA-204NC共转染MC3T3-E1细胞,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;miRNA-204mimics和miRNA-204inhibitor转染MC3T3-E1细胞,RT-PCR和western blot检测转染前后Runx2的mRNA表达量和蛋白表达量的变化。结果与空白组比较葛根素作用后Runx2的miRNA和蛋白表达均上升;miRNA-204表达水平下降;表达谱和靶点预测软件预测靶向Runx2的miRNA共同有miR-204、miR-3072-3p等;过表达miRNA-204后Runx2的蛋白表达水平下降,干扰miRNA-204表达后Runx2的蛋白水平上升。结论葛根素在成骨细胞中可通过调节靶向Runx2基因的miRNA-204来促进细胞增值分化。     

NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因（NS2TP）的转录调节机制。方法应用PCR方法扩增NS2TP的启动子,克隆入pGL4.10载体,构建萤虫素酶报告基因载体,转染HepG2细胞,检测双萤虫素酶活性,验证其转录活性;通过缺失突变法构建系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体。结果成功构建了系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体,分别命名为N1、N2、N3和N4,并确定了N3为NS2TP基因的核心启动子。结论构建NS2TP基因启动子的系列截短报告基因载体,确定了其最小转录活性区域,为进一步研究NS2TP基因的转录活性调节机制奠定理论基础。     

微小RNA-1246靶向糖原合成酶激酶3β激活Wnt/β-连环蛋白信号通路促进前列腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖

目的探讨微小RNA(miR)-1246靶向糖原合成酶激酶3β(GSK3β)对前列腺癌(PCa)细胞迁移、侵袭和增殖的作用及分子机制。方法采用miRNA-Seq技术检测PCa组织及癌旁组织中差异表达的miRNA;采用实时荧光定量聚合酶连反应(qRT-PCR)技术检测PCa患者癌组织和血清中miR-1246的表达水平;采用生物信息学分析、荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR、蛋白质印迹法分析miR-1246对GSK3β的靶向调控关系。人PCa细胞DU145和LNCaP分别转染miR-1246类似物(mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-1246抑制剂(inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor), 通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的增殖能力, 通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移侵袭能力。两组间比较采用独立样本t检验。结果 miRNA-Seq结果显示, 与癌旁组织比较, PCa组织中有15个miRNA表达显著升高, 51个miRNA表达显著降低, 其中miR-1246在PCa患者组织及血清中表达显著升高(组织:7.93±2.39比...     

微小RNA-630靶向调控锌指转录因子影响甲状腺癌细胞侵袭能力

目的观察甲状腺癌(TC)细胞中微小RNA-630(miR-630)对上皮-间充质转化(EMT)标志物锌指转录因子(Slug)表达的影响,及对细胞侵袭能力的影响。方法收集河北医科大学第二医院普外科2018年1月至2019年12月之间的40例乳头状甲状腺癌及其癌旁标本。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法检测甲状腺癌及其癌旁组织中miR-630的表达水平;将miR-630模拟物(mimics)转染至人乳头瘤状甲状腺癌细胞(TPC-1)细胞中,应用荧光定量PCR的方法观察Slug基因的表达水平,使用双荧光素酶报告基因实验观察miR-630对Slug基因的调控作用;同时,将过表达Slug质粒与miR-630 mimics共转染至TPC-1细胞,应用Transwell细胞侵袭实验观察miR-630和Slug表达变化对甲状腺癌细胞侵袭能力的影响,组间比较采用t检验。结果miR-630在乳头状甲状腺癌组织中的表达水平为(1.13±0.07),其表达水平明显低于癌旁组织表达水平(5.33±0.08),差异有统计学意义(t=15.472,P<0.05);miR-630 mimics上调甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中miR-630后,Slug mRNA表达水平(0.48±0.09)明显低于对照组细胞(1.03±0.07,t=7.132,P<0.05),差异有统计学意义;miR-630 mimics与Slug 3’非翻译区野生型共转染组荧光素酶活性明显低于对照组(0.38±0.03,t=13.021,P<0.05),差异有统计学意义。而miR-630 mimics与Slug 3’非翻译区突变型共转染组,荧光素酶活性却无明显变化(1.08±0.02比1.02±0.03,t=1.122,P>0.05),差异无统计学意义;miR-630 mimics组侵袭细胞数(241.3±42.4)明显低于对照组侵袭细胞数(467.5±51.7),差异有统计学意义(t=3.214,P<0.05);miR-630 mimics和Slug过表达质粒共转染组细胞的侵袭细胞数(411.6±28.3)与阴性对照组(NC,418.3±31.2)组比较,差异无统计学意义(t=1.131,P>0.05)。结论miR-630能够通过靶向抑制Slug的表达,抑制甲状腺癌细胞的侵袭能力。     

miR-96调控生育酚结合蛋白的表达及前列腺癌细胞生长

目的 筛选并鉴定调控生育酚结合蛋白(TAP)的miRNAs,并观察其对前列腺癌细胞增殖的影响.方法 生物信息学分析和双荧光报告筛选调控TAP的miRNAs；以前列腺组织总RNA1μg反转录并扩增TAP基因(SEC14L2,Gene ID:23541)及其3'端非翻译区(3’-UTR),克隆入p3 ×FLAG-CMVTM-7.1载体；miR-96类似物与TAP表达载体pCMV7.1-TAP、pCMV7.1-TAP-3’-UTR转染前列腺癌细胞DU-145,Western blot检测TAP的表达,噻唑蓝(MTT)法观察DU-145的增殖.结果 miR-96可作用于TAP的3’-UTR；pCMV7.1-TAP-3’-UTR分别经Not Ⅰ/BglⅡ、Sal Ⅰ/Xba酶切后电泳,在1200、1400 bp附近有目的条带,测序结果与Gene Bank报道一致.Western blot检测结果表明miR-96可使TAP表达下降65.1％ (P ＜0.05).MTT分析显示对照组以及空载体转染组的细胞吸光度(A)值分别为0.972 ±0.023、0.967±0.042;pCMV7.1-TAP转染组、pCMV7.1-TAP-3’-UTR转染组的A值分别为0.625±0.037、0.731±0.043,差异均有统计学意义(P＜0.05)；pCMV7.1-TAP-3’-UTR和miR-96共转染组的A值为0.914±0.034,与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miR-96可通过3’-UTR调节TAP的表达,并减弱TAP对前列腺癌细胞增殖的抑制作用.     

人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶基因启动子区克隆与活性分析

目的 克隆人肾组织γ-谷氨酰基羧化酶(cGCX)基因5'侧翼启动子区,并对其转录活性进行分析.方法 对GGCX基因5'侧翼区进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;从人肾组织中提取基因组DNA,以其为模板扩增GGCX基因启动子区,通过酶切鉴定及测序分析无误后,将其构建至萤光报告基因载体pGL3-basic中,瞬时转染至Hela细胞,检测萤光素酶水平,从而分析扩增启动子区的转录活性.结果 成功克隆长度为804 bp(-891～-88)的GGCX基因启动子片段,并构建相应的萤光素酶重组子pGL3.GGCX Promoter,转染Hela细胞48 h后检测萤光素酶活性显示,pGL3-GGCX Promoter与空质粒对照pGL3-basic相对萤光素酶值分别为16.92±4.01与0.02±0.01,pGL3-GGCXPromoter萤光素酶活性显著增强(P<0.05).Matlnspector等分析显示该片段具有多个转录因子结合位点.结论 成功构建含有GGCX基因启动子序列的萤光素酶报告系统,为进一步研究GGCX基因功能及其转录调控奠定了基础.     

G250启动子的克隆及其在人肾癌细胞中的特异生物活性

目的 克隆G250启动子并插入pG3-Basic真核表达载体,探讨G250启动子在肾癌细胞中的特异生物活性.方法 提取宫颈癌Hela细胞总DNA作为模板,设计两对引物进行PCR,获取两段不同长度的G250启动子片段.测序后分别将获取的551 bp和218 bp启动子片段克隆到pGL3-Basic载体中,构建双荧光素酶检测质粒pGLB-G551和pGLB-G218.将pGL3-Basic、pGLB-G551、pGLB-G218各1μg转染G250阳性宫颈癌Hela细胞、肾癌Ketr-3细胞.运用双荧光素酶检测技术,确定G250启动子的转录活性.结果 电泳与测序结果 显示,两段G250启动子片段与报道序列一致.酶切与测序结果 显示,质粒pGLB-G551、pGLB-G218构建成功.转染pGLB-G551、pGLB-G218的Hela细胞相对荧光素酶活性分别为pGL3-Basic的11.07倍、10.36倍.Ketr-3细胞分别为pGL3-Basic的5.17倍、4.13倍.与空载体pGL3-Basic比较,pGLB-G551和pGLB-G218的相对荧光素酶活性均明显增强(P<0.05).pGLB-G551和pGLB-G218比较,相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功克隆出肾癌特异性G250启动子,并证明具有良好转录活性,218bp的启动子片段已具有G250启动子的所有启动效果.     

miR-148-5p靶向H型血管调控因子Slit3的实验研究

目的 观察绝经后骨质疏松症中H型血管调控因子Slit3表达差异,进一步探讨其上游靶向调控miRNAs。方法 雌性SD大鼠随机分假手术组和模型组,Real-time PCR和免疫组化检测骨组织Slit3 mRNA和蛋白表达水平;生物信息学预测可能与Slit3-3’UTR互作的miRNAs,构建野生型和突变型Slit3-3’UTR重组荧光素酶报告载体,和miRNAs表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶报告基因测定荧光素酶活性验证miRNA对Slit3-3’UTR的靶向作用。结果 与假手术组相比,模型组Slit3 mRNA表达水平略上调和平均光密度显著上调,生物信息学预测Slit3-3’UTR与miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p和miR-374-5p存在碱基结合位点,野生型Slit3-3’UTR共转染miR-148b-5p荧光活性下调至空白对照组的68.91%,突变型Slit3-3’UTR共转染miR-148b-5p荧光活性未见下调。结论 Slit3可能是绝经后骨质疏松症H型血管的调控基因,miR-148b-5p与Slit3-3’UTR的靶向结合直接调控Slit3的表达水平。     

SP1被鉴定为miR-122-5p的一个转录因子

目的:miR-122-5p跟精子发生相关,本研究主要是探究miR-122-5p在睾丸内的转录因子. 方法:采用生物信息学方法预测到miR-122-5p启动子的可能转录因子为SP1和GATA4,然后分别构建双荧光素酶pGL3-miR-122-5p promoter载体、pcDNA3.1(+)-SP1表达载体和pcDNA3...