异种肝移植转基因小鼠模型的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59cDNA的启动子，CMV作为报告基因GFP的启动子，构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV—GFP—OMT-CD59基因片断注射入昆明种白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性，进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠，可用于进一步异种移植研究。     

异种肝移植模型-转入CD59蛋白基因小鼠的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59 cDNA的启动子．CMV作为报告基因GFP的启动子．构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV-GFP-OMT-CD59基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性．进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59 cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠。可用于进一步异种移植研究。     

异种移植动物模型-转人CD59 cDNA首建小鼠的培育

目的　培育转人CD5 9cDNA首建小鼠 ,以进一步研究异种移植 ,并为建立鼠系奠定基础。方法　构建转基因结构pEGFP -C1-OMT -CD5 9,限制性内切酶切除质粒载体 ,回收、纯化包括人CD5 9cDNA、绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein ,GFP)基因及各自启动子的约 3 .3kb的基因片段 ,用显微注射法将此片段注入小鼠受精卵 ;提取F0 代小鼠尾组织DNA ,用PCR法初选 ,再用Southern杂交法对PCR阳性鼠进一步筛选 ,确定阳性转基因首建小鼠。结果　共注射 5 90枚受精卵 ,移植于 2 4只受体母鼠中 ,出生F0 代小鼠 73只 ;PCR初选有 8只呈阳性(6♂∶2♀ ) ,Southern杂交有 2只呈阳性 (1♂∶1♀ ) ;经粗略估算 ,整合外源基因拷贝数分别为 3和 10。结论　成功地培育出转人CD5 9cDNA首建小鼠 ,用PCR和Southern杂交法证实了外源片段的整合     

人CD59/MCP双基因对人血灌注转基因小鼠离体心脏功能的保护作用

目的研究转人补体调节蛋白hCD59/hMCP双基因抑制人补体激活从而抑制补体介导的超急性反应、延长体外灌注小鼠心脏功能的作用。方法利用显微注射法建立转hCD59/hMCP双基因小鼠的模型,其子代中hCD59单基因阳性小鼠8只、hMCP单基因阳性小鼠11只和hCD59/hMCP双基因阳性小鼠8只分别为3个实验组,同窝非转基因小鼠10只为对照组。用新鲜人血浆体外灌注小鼠心脏,研究小鼠表达抑制人补体激活的人补体调节蛋白后,对补体介导的异种移植超急性排斥反应的抑制作用。结果转双基因组心脏搏动时间(138min±25min)明显长于单基因组(hCD59组78min±27min,hMCP组43min±21min)及非转基因组(20min±12min)(Dunnett′s T检验,均P<0.01);免疫荧光染色及免疫酶组织化学染色显示转双基因组心脏内补体C3c及C9沉积也明显减少。结论转人补体调节蛋白hCD59/hMCP双基因能够有效地抑制补体介导的异种移植超急性排斥反应。     

异种移植动物模型-转入CD59 cDNA首建小鼠的培育

目的：培育转人CD59cDNA首建小鼠，以进一步研究异种移植，并为建立鼠系奠定基础。方法：构建转基因结构pEGF-C1-OMT-CD59，限制性内切酶切除质粒载体，回收、纯化包括人CD59cDNA、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因及各自动启动子的约3.3kb的基因片段，用显微注射法将此片段注人小鼠受精卵，提取F0低小鼠尾组织DNA，用PCR法初选，再用Southern杂交对PCR阳性鼠进一步筛选，确定阳性转基因首建小鼠。结果：共注射590枚受精卵，移植于24只受体母鼠中，出生F0代小鼠73只；PCR初选有8只呈阳性（6♂：2♀），Southern杂交有2只呈阳性（1♂：1♀）；经粗略估算，整合外源基因拷贝数分别为3和10。结论：成功地培育出转人CD59cDNA首建小鼠，用PCR和Southern杂交法证实了外源片段的整合。     

转人CD59基因小鼠对人补体介导的免疫反应的保护作用

目的:探讨转基因小鼠血管内皮细胞特异性表达人CD59(hCD59)基因对人补体介导的免疫反应的保护作用。方法:通过显微注射方法建立转hCD59基因小鼠,采用PCR、Southernblot方法检测hCD59基因的整合,流式细胞仪检测hCD59蛋白的表达,人血清体外灌注转基因小鼠心脏、免疫组织化学染色补体C9及IgG评估排斥反应的情况。结果:转基因小鼠hCD59基因表达强度为人外周血白细胞的35%～120%,转基因小鼠体外灌注心脏存活时间明显延长(P<0.01),心脏补体C9沉积明显减少。结论:血管内皮细胞特异性表达hCD59可以减轻异种移植排斥反应,延长移植物的存活时间。     

Tw近交系小鼠的遗传鉴定和罕见基因分析

目的比较转染两个补体调节蛋白(CRP)基因与转染单一CRP基因对异种细胞的保护作用。方法采用双基因混合注射的方法,将人MCP(膜辅因子蛋白)和CD59(膜反应性溶解抑制物)两种基因导入521枚KM小鼠的受精卵原核。结果得到原代转hCD59基因小鼠14只,转hMCP基因小鼠12只,hCD59/hMCP双基因共整合的小鼠7只,转基因效率5%。通过5只G0代转双基因小鼠和非转基因小鼠的繁殖,得到F1转hMCP小鼠14只,转hCD59小鼠16只,转双基因小鼠10只,F1双基因占33.3%。用10%新鲜人血浆体外灌注小鼠离体心脏,转双基因组心脏搏动时间(138±25min)明显长于单基因组(hCD59组78±27min,hMCP组43±21min)和非转基因对照组(20±12min)。结论转染两个CRP基因比转染单一CRP基因对异种细胞有更好的保护作用。     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

24-脱氢胆固醇还原酶基因转基因小鼠血生化指标分析

目的建立全身表达24-脱氢胆固醇还原酶基因(Dhcr24)转基因小鼠动物模型,研究该基因过表达对小鼠代谢的影响。方法RT-PCR法克隆小鼠Dhcr24基因,把该基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24转基因小鼠。PCR鉴定Dhcr24转基因小鼠的基因型,RT-PCR和Western Blot检测基因表达水平,血生化检测仪检测转基因小鼠血生化指标的改变。结果建立了2个不同表达水平的Dhcr24转基因小鼠品系,转入的Dhcr24基因在肝和脾组织中的表达高于内源的Dhcr24。血生化检测证实:乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和血肌酐(SCr)较野生型小鼠明显降低,而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和碱性磷酸酶(ALP)较野生型小鼠明显增加,并且Dhcr24转基因雌鼠的体重比野生型小鼠明显降低,均有显著差异。但Dhcr24转基因雄鼠各项指标与野生型小鼠相比没有显著差异。结论成功建立了全身表达Dhcr24转基因小鼠,并证实Dhcr24基因对雌性小鼠的体重和血生化指标,包括LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP具有明显的影响。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

S100A16转基因小鼠的构建与鉴定

目的:构建系统表达S100A16基因型小鼠,为研究S100A16基因的生物学功能提供模型动物?方法:将S100A16 cDNA插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射方法建立转基因小鼠?PCR鉴定转基因小鼠的基因型,采用定量PCR(QPCR)方法筛选高表达品系?结果:成功构建S100A16转基因载体,建立了S100A16转基因小鼠,通过PCR及QPCR方法筛选出两个高表达品系(line A,line B)?结论:建立了系统表达S100A16的转基因小鼠,转入的S100A16基因在脂肪?肝脏?肌肉?肺等组织高表达,为研究S100A16的生物学功能特别是在肥胖中的作用及机制提供了动物模型?     

人多聚免疫球蛋白受体转基因鼠的建立

目的 构建携带有多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的转基因鼠，使其能以近乎自然的状态感染EBV，观察EBV在鼻咽部病变过程中的作用。方法 采用角质上皮特异性启动子ED—L2调控的pIgR基因，用显微注射方法将其导入受精卵中，使该基因能在F0代转基因鼠鼻咽部特异性表达。结果 PCR检测F0代pIgR基因阳性率达37．5％(6／16)，Southem杂交F0代pIgR基因阳性率为12．5％(2／16)。结论 表达多聚免疫球蛋白受体的转基因动物有望成为研究EBV病毒致病机制的一种新的动物模型。     

人多聚免疫球蛋白受体转基因鼠的建立

目的构建携带有多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的转基因鼠,使其能以近乎自然的状态感染EBV,观察EBV在鼻咽部病变过程中的作用。方法采用角质上皮特异性启动子ED-L2调控的pIgR基因,用显微注射方法将其导入受精卵中,使该基因能在F0代转基因鼠鼻咽部特异性表达。结果PCR检测F0代pIgR基因阳性率达37.5%(6/16),Southern杂交F0代pIgR基因阳性率为12.5%(2/16)。结论表达多聚免疫球蛋白受体的转基因动物有望成为研究EBV病毒致病机制的一种新的动物模型。     

Transgenic mice with overexpression of human scavenger receptor A on endothelial cells

Objectives To establish a new transgenic mouse model for determining the function and role of human scavenger receptor A (SR- A) in atherosclerosis in vivo. Methods Human scavenger receptor minigene- driven mouse tie- 1 promoter was constructed and confirmed by endonuclease digestion and sequence analysis. Transgenic mice were generated via the microinjection method. PCR and Southern blot were used t o screen the positive transgenic mice. RT- PCR and immunohistochemical analysis were used to detect the level and location of human SR- AⅠ expression in transgenic mice. The activity of human SR- AⅠ was determined by morphologi c observation of aortic endothelial cells of transgenic mice under transmission electron microscopy. Results The electrophoresis assay showed the expected 4 fragments of 0. 9 kb, 1. 1 kb, 1. 2 kb and 4. 2 kb in the SmaⅠ digest and 2 fragments of 0. 8 kb and 6 . 7 kb in BglⅡ digest of plasmids pTie- 1/hSR- A. The fragment sequence of tie - 1 p romoter and human SR- A cDNA in plasmids pTie- 1/hSR- A was correct and no A TG b efore the translation initiation sites of human SR- A was found by sequence ana lysis. 561 injected and surviving embryos with the purified human SR- A minigen e were implanted into the oviducts of 19 ICR pseudopregnant mice. Among the 54 surviving pups from 13 foster mothers, 7 were identified by PCR and Sou thern blot analysis. The results of RT- PCR and immunohistochemical analysis sh owed human SR- A was specifically expressed on vascular endothelial cells of the aorta and renal artery, as well as hepatic sinusoidal endothelial cells in tran sgenic mice. Transmmion electron microscope (TEM) of aorta of transgenic mice s howed that a large number of vesicles, multivesicle bodies and swollen mitochond ria filled the plasma of endothelial cells. Conclusions A transgenic mouse model with overexpression of human SR- A in endothelial cells was successfully established. The transgene was integrated and transmitted int o the chromosome of transgenic mice. Tie- 1 promoter controlled the transgene t o express in endothelial cells in mice. Pinocytic activity of aortic endothelia l cells in transgenic mice was higher than that of C57BL/6J mice. Our studies w ill provide a new transgenic model for investigation of atherosclerosis and func tions of human SR- A.     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.