单克隆抗体鉴别溶组织内阿米巴的致病性

用由溶组织内阿米巴致病株（ＨＭ－１：ＩＭＳＳ）为免疫原诱导产生的特异性单克隆抗体（ＭｃＡｂ）４Ｇ６，与从急性阿米巴痢疾患者或包囊携带者分离的溶组织内阿米巴（Ｅｈ）滋养体进行间接荧光抗体反应和淀粉凝胶电泳同工酶分析。显示，从有发热、腹泻、脓血便患者体内分离的虫株与ＭｃＡｂ４Ｇ６出现阳性反应，滴度达１：５１２０；同工酶分析也属于致病性酶株群Ⅱ。而有发热、腹泻、无脓血便患者体内分离的虫体与ＭｃＡｂ４Ｇ６均为阴性反应，且为非致病性酶株群Ⅰ。提示，致病性虫株与非致病性虫株的免疫原性不同，应用本法可准确鉴别致病性虫株，且简便、价廉、快速，还可用于流行病学调查。     

单克隆抗体鉴别溶组织内阿米巴的致病性

用由溶组织内阿米巴致病株为免疫原诱导产生的特异性单克隆抗体４Ｇ６，与从急性阿米巴痢疾患者或囊携带者分离的溶组织内阿米巴滋养体进行间接荧光抗体的反应和淀粉凝胶电泳同工酶分析。显示，从有发热，腹泻，脓血便患者体内分离的虫株与ＭｃＡＢ４Ｇ６出现阳性反应，滴度达１：５１２０；同工酶分析也属于致病性酶株群Ⅱ。而有发热，腹泻，无脓血例患者体内分离的虫体与ＭｃＡｂ４Ｇ６均为阴性反应，且为非致病性酶株群Ⅰ。提示，     

多聚酶链反应鉴别致病性与非致病性的溶组织内阿米巴虫株

多聚酶链反应是体外DNA增殖的新技术。在多聚酶、dNTP和引物的参与下在数小时内使特异性的DNA顺序大量增殖。用B、C、G、T4株溶组织内阿米巴的DNA增殖30周期后,作凝胶电泳分析,发现致病性虫株的引物不能使B、C、G、T虫株的DNA增殖,凝胶电泳不出现条带;而非致病性虫株的引物能使B、C、G、T虫株的DNA增殖,凝胶电泳出现特异性条带。用辣根过氧化物酶标记致病性虫株DNA探针与B、C、G、T的DNA进行斑点杂交呈阴性反应;而用非致病性虫株DNA探针与B、C、G、T的DNA斑点杂交呈阳性反应。实验结果显示B、C、G、T为非致病性虫株,与同工酶分析一致。多聚酶链反应是鉴别致病性和非致病性溶组织内阿米巴虫株的高特异性和敏感性方法,为从分子生物学研究溶组织内阿米巴的致病机理提供一新技术。     

用限制性内切酶分析溶组织内阿米巴的致病性

用ＳＨ－３，ＳＨ－５，ＳＨ－６，ＳＨ－７和ＳＨ－８５株溶组织内阿米巴的ＤＮＡ增殖３５个周期，将其基因ＤＮＡ用内切酶ＨｉｎｆＩ和ＥｃｏＴ２２Ｉ进行消化后，作琼脂糖凝胶电泳分析，显示，５株虫株ＤＮＡ经３５个循环周期后产生５３１－ｂｐ的产物；经ＨｉｎｆＩ消化后，ＳＨ－３，ＳＨ－５，ＳＨ－６和ＳＨ－７的基因ＤＮＡ产生３个相同的片段，而显示其均与非致病性虫株ＳＡＷ１４２的电泳谱完全相同；而ＳＨ－８基因ＤＮ…     

溶组织内阿米巴同工酶的初步研究

用3株溶组织内阿米巴及1株侵入内阿米巴以琼脂糖凝胶电泳法检测其四种酶的同工酶,即:苹果酸酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖变位酶、己糖激酶,以酶谱来区别不同的酶株群。结果显示:3株溶组织内阿米巴与侵入内阿米巴的同工酶谱有显著差异,但3株溶组织内阿米巴的酶谱几无差异,属于强致病的酶株群ⅩⅣ,对来源不同的溶组织内阿米巴,却属同一酶株群的原因进行了讨论。     

PCR鉴别致病性和非致病性溶组织内阿米巴原虫感染

选用编码溶组织内阿米巴原虫３００００－Ｍｒ抗原的基因片段中不同的保守序列作ＰＣＲ引物，建立检测原虫ｃＤＮＡ的两种方法，来鉴别致病性和非致病性原虫株，其结果与同工酶电泳谱株群分析、特异性单抗检测３００００－Ｍｒ抗原相比，对病原含量少的标本检出率高，敏感性强。     

对阿米巴肝脓液中的溶组织内阿米巴种特异基因的分析

目的：分析引发肝脓肿的溶组织内阿米巴虫株的种特异基因（SSG）的差异。方法：直接从阿米巴肝脓液中扩增溶组织内阿米巴SSG，以溶组织内阿米巴HM－1；IMSS株SSG扩增产物为探针，用southern杂交的分析方法SSG的多态性。结果：扩增出的HM－1：IMSS株的SSG长650bp；14例阿米巴肝脓肿患的肝脓液中有4例未检出溶组织内阿米巴的SSG基因，其余10例的SSG具多态性，在650bp-980bp之间呈梯形分布。结论：使受检致病的溶组织内阿米巴虫株存在种内差异，其临床意义有待进一步研究。     

用限制性核酸内切酶分析钩端螺旋体DNA的研究

作者选用钩体赖型56601株、017株、秋季型56606株、曼耗2型67020株、1987年分离株87112、87369株,用内切酶EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ、Hha Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析其DNA,结果表明:钩体017株的四种内切酶图谱明显不同,在EcoR Ⅰ酶切图谱上,赖型、秋季型、曼耗2型钩体DNA的主要差别在高分子区带,赖型强毒力株017较同型弱毒力株56601在10.5kb处染色较深;三型钩体的Hind Ⅲ酶切图谱仅有细小差异;分离株87112和87369的EcoR I 酶切图谱与赖型56601和017基本一致。在HindⅢ酶切图谱上,分离株87112与赖型56601株、017株相似。提示:限制性核酸内切酶分析可以作为钩体分型和鉴定的手段。     

溶组织内阿米巴与哈门氏内阿米巴感染的调查

我国各地区溶组织内阿米巴(又名痢疾阿米巴、痢疾变形虫)的感染率悬殊较大,高者可达30％,低者仅为0.37％;华北地区一般较华中及华南地区低。由于此种致病性阿米巴感染引起的发病例占少数,各地学者对其致病力的见解不同,如有些学者依据其滋养体及包囊的大小、形态结构结合虫株毒力。对人体及动物产生的病变以及在培养基上繁殖的情况,作为划分宗、株与致病的关系。综合文献资料,多数学者认为大宗阿米巴,它们的滋养体直径在12微米以上,包囊直径在10微米以上者为大型致病性阿米巴,命名为溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica);小宗阿米巴,它们的滋养体直     

PCR法检测粪便样本溶组织内阿米巴的初步研究

  目的  建立直接检测粪便样本中溶组织内阿米巴的PCR方法。  方法  根据溶组织内阿米巴标准株基因组中小亚基核糖体RNA（small subunit ribosome RNA,SSU rRNA）序列合成4对特异性引物（2对自主设计引物和2对参考引物）,建立PCR检测方法,用该方法对221例临床腹泻患者粪便标本进行检测,同时采用病原学碘染涂片镜检法和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测抗原,对3种方法的阳性率进行比较,并采用Kappa检验进行一致性分析,分析3种检测方法结果的准确性。  结果  4对引物均扩增出溶组织内阿米巴特异的目的片段,建立了粪便样本溶组织内阿米巴检测的PCR法。选择其中2对引物（1对自主设计引物和1对参考引物）对221例粪便样本进行PCR扩增,同时用碘染涂片镜检法查病原体,用ELISA法进行抗原检测,3种方法溶组织内阿米巴阳性检出率分别为2.26%、0.90%和9.50%,差异有统计学意义（χ2=23.34, P<0.01）。PCR法与碘染涂片镜检法比较,Kappa值为0.216,一致性微弱;PCR法与ELISA法比较,一致性差,Kappa值为–0.134。PCR法的结果与临床诊断的一致性最好。  结论  本研究通过自行设计引物建立的粪便样本溶组织内阿米巴PCR检测法在准确性上优于镜检法和ELISA抗原检测法,为该方法用于临床诊断提供了实验基础。     

国内首次发现携带耶尔森菌HPI毒力岛rip^-2也基因的阴沟肠杆菌

目的研究感染性腹泻患者粪便中分离的阴沟肠杆菌携带的小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp-^2基因，并评价其菌株的毒力和耐药情况。方法PCR扩增法检测毒力岛irp^-2基因，小白鼠腹腔注射法捡测毒力，药敏试验采用K—B纸片扩散法。结果从感染性腹泻患者粪便中分离的9株阴沟肠杆菌均扩增出irp^-2基因片段，其相对分子量与对照菌株小肠结肠炎耶尔森菌WA株（08型）的相应PCR片段一致，并具有较强的毒力。结论检出的阴沟肠杆菌含有小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛irp^-2基因且为具有毒力的菌株，与致病性密切相关。     

Zmu-1:DHP豚鼠的随机扩增多态性DNA分析

目的：研究Zmu-1：DHP豚鼠基因组DNA的遗传多态性及其遗传概貌，探讨随机引物PCR(RAPD—PCR)在豚鼠遗传质量检测中运用的可行性。方法：用RAPD—PCR法，对新培育的Zmu—1：DHP豚鼠和对照品系DHP豚鼠的基因组DNA进行PCR扩增。结果：从40条随机引物中，筛选出2条呈多态性的引物，分别是第S1202号和第S1219号引物。Zmu—1：DHP品系的扩增产物无多态性变化，而且其条带与多数DHP品系的个体相同。少数DHP品系的个体呈多态性变化，并找到该品系增加和缺失的特征性条带各一种。结论：Zmu—1：DHP品系的基因纯合性及个体一致性较DHP品系高。二个品系的DNA序列存在较少差异，说明豚鼠品系间遗传结构比较接近。一旦选定具有多态性的引物，RAPD—PCR法可以区分豚鼠品系，适用于豚鼠遗传质量检定。     

中华按蚊不同地理株基因组DNA的多态性

目的：研究中华按蚊不同地理株基因组ＤＮＡ的多态性。方法：应用ＲＡＰＤ技术，用２０个随机引物（ＯＰＥ０１￣ＯＰＥ２０）对江苏，福建，海南，贵州，陕西５个省区中华按蚊的基因组ＤＮＡ进行了ＰＣＲ扩增。     

rDNA ITS序列在鉴定尖端赛多孢子菌中的应用

为探明一例眼外伤摘除的眼球活组织中培养分离出的一株形态特异的尖端赛多孢子菌的分子生物学特征及其与波氏假阿利什菌、一般尖端赛多孢子菌标准株的亲缘关系,采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增其ｒＤＮＡ中基因间转录区（ＩＴＳ）,并对ＰＣＲ产物进行限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）。结果发现,形态特异的尖端赛多孢子菌株与标准株及其它同种菌株具有相同的酶切图谱,而与顶孢霉和烟曲霉则不一致,表明该菌株就是波氏假阿利什菌的无性期。该标准菌株的ＩＴＳ序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌及其有性期,以便于临床早期诊断和及时治疗。     

弓形虫DNA疫苗在免疫鼠体内的分布情况研究

目的观察弓形虫疫苗pcDNA3.1-P30-P22免疫小鼠后在小鼠体内的分布情况。方法雌性BALB/c系小鼠,随机分成3组,每组12只,第1组为pcDNA3.1-P30-P22免疫组,第2组为空质粒pcDNA3.1对照组,第3组为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组;免疫组经肌内注射免疫,于免疫后4周和8周,分别取小鼠的注射部位肌肉、血液、肝脏及脾脏抽提组织DNA,并以此为模板进行多聚酶链反应(PCR)扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。结果免疫后4周,免疫组小鼠的上述器官均扩增出P30-P22基因片断,对照组均未扩增出相应片断,与预期结果相符;免疫后8周,仅免疫鼠血液扩增出上述特异性片断。结论弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-P30-P22免疫小鼠后,重组质粒能被多个组织摄取,但在不同组织中存留的时间不同。     

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆

为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株,作者采用ＰＣＲ对霍乱弧菌毒力表达调控基因ｔｏｘＲ进行扩增及克隆,并对霍乱弧菌ｔｏｘＲ基因进行限制性酶切分析。结果显示：７株霍乱弧菌均扩增出１．３ｋｂ的ｔｏｘＲ基因片段,ｔｏｘＲ基因中部含有ＥｃｏＲⅠ酶切位点,再将ＴｏｘＲ基因克隆在质粒ｐＡＴ１５３上,对所获的重组质粒ｐｔＲ４进行限制性酶切分析,证实质粒ｐｔＲ４插入的１．３ｋｂ的ＤＮＡ片段为ｔｏｐ     

浙江省萧山区轮状病毒A组G型和P型基因同源性比较与进化分析

目的分析浙江省萧山区婴幼儿急性腹泻患者中分离的轮状病毒A组G型、P型的基因序列,探讨该病毒的遗传变异和分子特性。方法收集2010年6～12月浙江省萧山区急性婴幼儿（≤5岁）腹泻患者粪便标本,应用多重PCR技术从临床标本中扩增轮状病毒A组G型、P型基因片段并测序分析,比较基因的亲缘关系并绘制进化树。结果162例粪便样本,ELISA结果为54例阳性。PCR检测结果G1型为32株,G2为5株,G3为9株,P型中,P4为3株,P8为5株,成功地对16例A组轮状病毒基因进行测序。2010年A组轮状病毒基因的核苷酸序列与参考株具有较高的同源性,且A组基因核苷酸序列发生了一定的变异。结论轮状病毒A是引起浙江萧山地区急性腹泻的主要的病原之一,其病原具有基因型别的多样性,Gl型可能是2010年浙江萧山地区流行的优势株。     

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人BRD8启动子系列报告基因的构建和鉴定

目的: 构建具有相同3'末端而5'末端逐渐截短的人BRD8启动子系列报告基因,并进行鉴定。方法: 聚合酶链反应(PCR)从人基因组中扩增BRD8启动子片段并插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic;以已构建的BRD8报告基因为模板,分别用PCR扩增具有相同3'末端而5'末端逐渐截短的BRD8启动子系列片段,并分别插入pGL3-Basic载体。对BRD8启动子系列报告基因进行酶切鉴定、测序。结果: 通过酶切鉴定、测序,证明构建的BRD8启动子系列报告基因序列和方向正确。结论: 成功构建了人BRD8启动子系列报告基因,为进一步研究调节BRD8基因表达的特异性转录因子和(或)沉默子奠定了基础。