人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6.方法采用基因重组技术,用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3kb和1.7kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5kb和O.5kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础.     

正、反义Heparanase基因荧光真核表达载体的构建及胰腺癌SW1990细胞转染

目的构建正、反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并转染人胰腺癌SW 1990细胞.方法用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正、反义真核表达载体转染人胰腺癌SW 1990细胞,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶正、反义真核表达载体,并成功转染人胰腺癌细胞株SW 1990,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对胰腺癌细胞的转移能力的影响奠定基础.     

正反义人Tankyrase基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人Tankyrase正义和反义真核表达载体．方法：用EcoRⅠ从TT20质粒上切下约3．44kb的Tankyrase cDNA片段，然后连入pcDNA3．1／Zeo的EcoR Ⅰ酶切位点上，经BamH Ⅰ酶切鉴定出正义和反义表达载体．结果：经BamH Ⅰ酶切后，正义质粒形成5．0 3．4kb两条带，而反义重组质粒为8．2 0．2kb两条带，与理论计算值完全一致．结论：成功构建了人Tankyrase的正、反义真核表达载体。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

hTERT基因荧光真核表达载体的构建及表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义荧光真核表达载体，并检测其在人胚胎成纤维细胞中的表达．方法：采用基因重组技术，将hTERT cDNA正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-EGFP中，NotI酶切鉴定；采用脂质法，将重组基因pIRES2-EGFP-hTERT转染入原代培养的人胚胎成纤维细胞；采用激光共聚焦显微镜、RT-PCR及Western blot检测hTERT在胚胎成纤维细胞中的表达．结果：经NotI酶切后，hTERT正义重组质粒被切成1．4kb和7．4kb2个片段，反义重组质粒为4．8kb和4．0kb2个片段，与理论预期长度相符；pIRER2-EGFP-hTERT重组基因经脂质法转染，G418筛选，获得一个阳性克隆，激光共聚焦显微镜下可见明显的绿色荧光，RT-PCR及Western blot可见hTERT mRNA转录及其蛋白的表达。结论：成功构建了h TERT正义荧光真核表达载体，并可在人胚胎成纤维细胞中表达。     

可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox的构建与表达

目的 探讨以hTERT作为永生化基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因puro作为筛选基因、加强型绿色荧光蛋白EGFP作为报道基因、loxP作为重组位点构建可回复性永生化逆转录病毒载体。为建立可回复性永生化细胞株奠定基础。方法 用NheⅠ酶切线性化pBABE-puro产生两个相同的黏端，与loxP双链混合连接构建成载体pBABE—puro—lox；用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切下逆转录病毒载体pBABE—hTEKT-puro上约3．5kb hTERT基因片段，插入pBABE-puro—lox载体的相应酶切位点之间，重组的新载体称为phTERTPlox；扩增出无终止密码子的EGFP基因片段并插入phTERTPlox，正确构建的载体命名为phTERTGPlox。转染包装细胞PT67并用嘌呤霉素选择培养，在荧光显微镜下观察绿色荧光细胞，免疫组化染色检测hTERT基因的表达。结果 EcoRⅠ和NheⅠ双酶切鉴定phTERTGPlox形成4．0kb和5.3kb两个片段，转染PT67细胞荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光细胞，免疫组化染色结果显示稳定转染的细胞胞核呈阳性染色。结论 成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox。     

正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆正、反义人PIN1基因（hPIN1）及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体.方法 应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出990bp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1.结果 扩增的cDNA经测秩序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5.3 ＋0.99kb 两条带,与理论计算值完全一致.结论 成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞及对其增殖的影响

目的：观察bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞（bMSCs）后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法：将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白基因的表达,计算转染率,用MTT检测转染细胞的增殖特性。结果：实验成功地构建了绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,倒置荧光显微镜下观察到转染后的bMSCs发出稳定的绿色荧光信号,转染率为（43.32±4.51）%,MTT法显示重组质粒组增殖速度显著高于空白质粒组和未转染细胞组（P〈0.05）。结论：运用转染的方法实现了两种基因在MSCs中的共同表达,为监控MSCs细胞的转染和表达过程提供了一种手段。为后期利用MSCs细胞进行组织工程骨组织制造和移植提供了规范化的监控和程序化生产手段。     

乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选

目的：构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶（Hpa）特异性基因真核表达载体．方法：分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链,经退火、连接和磷酸化后得到Hpa shRNA双链,将两两随机问隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluoreseent protein,EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1中,构建3条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil-1-Hpa—shRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率,免疫组化分析Hpa蛋白表达．结果：酶切与测序证实pGenesil-1-HPSE—shRNA构建成功,无任何碱基突变,3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化,3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别．结论：构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil-1-Hpa-shRNA．     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人骨唾液酸蛋白（hBSP）正反义真核表达载体，并检测其在骨肉瘤细胞MG-63中的表达。方法 以人骨膜细胞总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出hBSP全长序列，通过DNA重组技术构建hBSP正反义核酸真核表达载体，并用脂质体介导转染人MG-63细胞，通过RT-PCR及Western blot检测细胞中hBSPmRNA和蛋白的表达。结果 成功构建了hBSP正反义核酸真核表达载体，转染后有效表达hBSP，正义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平升高，反义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平降低。结论 转染正反义hBSP表达载体导致瘤细胞BSP表达的改变，为进一步实验研究提供了基础。     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

Survivin 反义RNA/HSP70双基因对MCF-7细胞的影响

目的 探讨survivin反义RNA/HSP70双基阂转染对乳腺癌细胞系MCF-7的影响.方法 将已成功获得的双基因载体(pIRES2-EGFP-survivin反义RNA/HSP70)用脂质体介导转染乳腺癌细胞系MCF-7,转染72 h,收集各组细胞,用倒置荧光显微镜观察并证实转染是否成功;采用real-time PCR方法检测细胞内survivin基因mRNA水平的表达变化;用Western blotting检测细胞HSP70蛋白表达变化;应用Annexin-V-cy5/7AAD双染后流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 转染双基因载体与转染空载体的乳腺癌细胞系MCF-7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光;将转染双基因载体的MCF-7细胞与转染空载体的MCF-7细胞和未转染的MCF-7细胞相比,survivin mRNA表达水平降低,并有效诱导细胞发生凋亡,而HSP70蛋白表达升高.结论 Survivin反义RNA与HSP70双基因转染成功;survivin反义RNA能干扰MCF-7内源survivin的表达,诱导细胞凋亡;HSP70能上调MCF-7细胞HSP70蛋白的表达.     

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶在真核细胞中的表达

目的:分别构建杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶(DsGPI)绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。方法:PCR扩增得到上、下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的DsGPI基因,双酶切后与绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1连接,得到重组载体pEGFP-C1-DsGPI,转染狗肾细胞MDCK,观察绿色荧光蛋白在细胞中的定位;同理将上、下游分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DsGPI基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,得到pcDNA3.1-DsGPI,转染食管癌EC9706细胞,分别应用RT-PCR法和Westernblot法检测DsGPI mRNA和蛋白的表达。结果:DsGPI在MDCK细胞中定位于细胞核,在EC9706细胞中被有效表达。结论:成功构建了DsGPI的绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。