逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因的稳定转染细胞系的建立

目的 应用 Slingshot(SSH)-1L重组逆转录病毒载体,建立过表达该基因的稳定转染细胞系.方法 用脂质体法将含SSH-1L的重组逆转录病毒载体pLNCX-SSH-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定.收集病毒上清感染MG63细胞,G418筛选.结果 应用 pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×10~8 CFU /L的病毒上清,感染MG63细胞,获得了过表达SSH-1L基因的MG63细胞.结论 应用SSH-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的稳定细胞系.     

HSV1-tk基因逆转录病毒载体构建、病毒包装及稳定细胞株建立

目的构建携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,包装后产生携带相应基因的逆转录病毒并稳定感染T47D乳腺癌细胞。方法用PCR方法扩增HSV1-tk基因,利用基因重组技术构建逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,经PCR及BamHI、SalI双酶切鉴定后与gag-pol和env表达载体用脂质体法共同转染293T包装细胞,产生含有HSV1-tk基因的逆转录病毒并用其感染T47D细胞,经G418筛选获得稳定表达株,命名为tk/T47D。结果构建了携带HSV1-tk基因的逆转录病毒载体pDON-AI-HSV1-tk,并通过PCR及BamHI、SalI双酶切证实。包装产生的逆转录病毒提取病毒基因组后PCR扩增出目的基因HSV1-tk,并成功地建立稳定表达HSV1-tk基因的T47D细胞。结论成功的构建了含有HSV1-tk基因的逆转录病毒载体并包装出携带相应基因的逆转录病毒,建立稳定表达HSV1-tk基因的乳腺癌T47D细胞株。     

HSV-TK逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度测定

目的 建立HSV-TK逆转录病毒包装细胞系并获得高产病毒的细胞株.方法 将TK基因与逆转录表达载体PLEGFP-N1连接后转染到包装细胞PA317中,经G418及荧光蛋白双重筛选得到高产病毒的细胞株.结果 经酶切鉴定成功构建PIEGFP-N1-TK重组载体,含HSV-TK基因重组逆转录病毒包装细胞PA317成功建立,经病毒滴度测定获得高产病毒的PA317/TK细胞株.结论 制备的重组病毒具有感染靶细胞的活性,为进一步应用HSV-TK基因进行肺癌的自杀基因治疗研究奠定基础.     

逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因稳定转染人骨髓间充质干细胞系的建立

目的 建立过表达该基因的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)稳定转染细胞系.方法 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs .应用脂质体法将Slingshot-1L 重组逆转录病毒载体pLNCX-Slingshot-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定.收集病毒上清感染第2代hMSCs,G418筛选,挑选阳性克隆,扩增培养.结果 采用密度梯度离心法联合贴壁培养法成功分离、纯化了hMSCs,应用pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,获得滴度为5×10~8 CFU /L的病毒上清.收集病毒上清感染hMSCs,获得了过表达Slingshot-1L基因的hMSCs.结论 应用Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的hMSCs稳定转染细胞系.     

小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2重组逆转录病毒载体在NIH3T3细胞中的表达

目的通过应用重组逆转录病毒介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2)基因整合入MH3T3细胞基因组中并进行表达.方法从经测序证实含正确序列mPPARγ2的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下约1.5Kb的mPPARγ2全长cDNA编码序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.pGCEN/mPPARγ2及pGCEN经LipofectAMINE感染病毒包装细胞系PA317细胞,通过筛选PA317细胞G418抗性克隆,收集病毒上清,然后用其感染靶细胞NIH3T3细胞,用免疫荧光染色及Westem印迹方法鉴定mPPARγ2在NIH3T3细胞中的表达情况.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体,获得了滴度分别为5×104CFU/ml和6×105CFU/ml的pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的病毒上清.经鉴定pGCEN/mPPARγ2能有效地感染靶细胞NIH3T3细胞并表达mPPARγ2.结论本研究结果为在体外建立脂肪细胞分化模型及为进一步研究PPARγ2在诱导脂肪细胞分化中的分子机制奠定了基础.     

人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定.利用电穿孔方法 将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度.结果 PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果 和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml.结论 成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

慢病毒-HBx表达载体的构建及其在人正常肝细胞系Chang liver的稳定表达

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus x,HBx)慢病毒表达载体,建立稳定表达HBx蛋白的人正常肝细胞系Chang liverHBx.方法:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法从质粒中扩增HBx基因,并克隆到慢病毒p EB-3xflag-GP-Puro载体上,经PCR、酶切和测序鉴定正确后经慢病毒包装感染人肝细胞Chang liver,再用嘌呤霉素筛选出稳定表达HBx蛋白的细胞株,最后用免疫荧光和Western blot技术检测HBx蛋白的表达.结果:酶切鉴定和基因测序证实HBx基因成功克隆到慢病毒表达载体上,重组慢病毒经包装纯化后获得滴度为1×108 TU/m L,用包装好的重组慢病毒感染人肝细胞Chang liver,经嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株Chang liver-HBx,利用免疫荧光和Western blot技术检测发现细胞株Chang liver-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBx的重组慢病毒表达载体,获得了稳定表达HBx的Chang liver细胞系Chang liver-HBx,为进一步研究HBx诱导正常肝细胞恶性转化提供细胞模型.     

pSLX-CMV/TβRII-IgG1Fc载体的构建

目的构建表达人TGFβ1II型受体细胞外结合区和人IgG1Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础。方法以RTPCR方法扩增目的基因TβRIIIgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEMTEasy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRIIIgG1Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLXCMV中,重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度。结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系。结论成功构建了重组质粒pSLXCMV/TβRIIIgG1Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径。     

pSLX-CMV/TβRⅡ-IgG1 Fc载体的构建

目的构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法以RT-PCR方法扩增目的基因TβRII-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRII-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pSLX-CMV中,重组质粒pSLX-CMV/TβRII-IgG1 Fc在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论成功构建了重组质粒pSLX-CMV/TβRII-IgG1 Fc,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

人EFTUD2基因靶向小分子化合物筛选细胞模型的建立*

目的 体外建立一个以荧光素酶为报告基因,靶向人EFTUD2基因的化合物筛选细胞模型。方法 应用限制性内切酶双酶切LV6载体,将人EFTUD2pro-0.5kb启动子和荧光素酶报告基因的融合片段重组入LV6慢病毒载体。以重组慢病毒感染HepG2细胞,采用嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得Epro-LUC-HepG2细胞株。利用荧光素酶报告基因系统挑选最佳单克隆细胞株并扩大培养。结果 准确构建了LV6-Epro0.5-LUC慢病毒载体,并成功筛选出可稳定表达荧光素酶的Epro-LUC-HepG2单克隆细胞株。根据荧光素酶报告基因检测结果,挑选了最佳克隆株细胞,被命名为Epro-LUC-HepG2细胞。结论 我们成功构建了以人EFTUD2基因为靶点的Epro-LUC-HepG2细胞化合物筛选模型,有助于后续筛选新型靶向免疫调节药物。     

携带泛素-HBcAg融合基因的慢病毒表达载体构建及其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟

目的构建携带泛素-HBcAg融合基因的慢病毒表达载体,包装成重组慢病毒并观察其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞（DC）成熟。方法 PCR扩增Ub-HBcAg融合基因,插入到慢病毒骨架质粒pWPXLd中,构建重组质粒pW-Ub-HBcAg。将构建的重组慢病毒质粒pW-Ub-HBcAg和包装质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G用脂质体共同转染293T细胞,获得携带Ub-HBcAg基因的重组慢病毒LV-Ub-HBcAg,并检测其在293T细胞中的表达。体外分离培养小鼠髓源性DC,加入重组慢病毒,流式细胞仪测定DC表面分子表达,ELISA测定DC培养上清中IL-12分泌水平。结果强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒表达载体经测序证实目的基因序列及插入方向均正确,W estern b lot能检测到目的蛋白在293T细胞中的表达。LV-Ub-HBcAg能上调DC表面分子的表达（CD86、CD80、MHC-Ⅱ类分子）,并且能促进DC分泌IL-12（139.2±10.75）pg/mL,明显高于LV-HBcAg组分泌的量（P〈0.01）。结论成功构建了携带强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒,转染293T细胞后能够稳定表达目的基因,并且能诱导DC分化、成熟,上调表面共刺激分子的表达,促进IL-12因子的分泌。     

过氧化物酶体增殖体激活受体γ2表达诱导NIH3T3细胞向脂肪细胞分化

目的通过应用重组逆转录病毒介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2)基因整合入NIH3T3细胞基因组中进行表达,并研究其功能.方法从经测序证实含正确序列mPPARγ2的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下mPPARγ2全长cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.对pGCEN/mPPARγ2及pGCEN进行包装及G418抗性筛选,收集病毒上清,感染靶细胞NIH3T3细胞,进行G418抗性筛选并进行扩增.在含过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)激活物5,8,11,14-二十碳四烯酸等分化介质中,诱导PPARγ2表达增加,使NIH3T3细胞向脂肪细胞分化.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体,获得了滴度分别为5×104CFU/ml和6×105CFU/ml的pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的病毒上清.经油红O染色证实分化10d的表达mPPARγ2的NIH3T3细胞中明显积聚了较多的中性脂肪,其细胞形态也与体内成熟脂肪细胞相似.结论本研究在体外建立了由PPARγ2诱导NIH3T3细胞向脂肪细胞分化模型,为进一步研究脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础.     

小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2重组逆转录病毒载体在NIH3T3细胞中的表达

目的　通过应用重组逆转录病毒介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2 )基因整合入NIH3T3细胞基因组中并进行表达。方法　从经测序证实含正确序列mPPARγ2的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2 中 ,双酶切下约 1.5Kb的mPPARγ2 全长cDNA编码序列 ,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2 。pGCEN/mPPARγ2 及pGCEN经LipofectAMINE感染病毒包装细胞系PA317细胞 ,通过筛选PA317细胞G418抗性克隆 ,收集病毒上清 ,然后用其感染靶细胞NIH3T3细胞 ,用免疫荧光染色及Western印迹方法鉴定mPPARγ2 在NIH3T3细胞中的表达情况。结果　构建了含mPPARγ2 全长cDNA重组逆转录病毒载体 ,获得了滴度分别为 5×10 4 CFU/ml和 6× 10 5CFU/ml的pGCEN/mPPARγ2 及pGCEN的病毒上清。经鉴定pGCEN/mPPARγ2 能有效地感染靶细胞NIH3T3细胞并表达mPPARγ2 。结论　本研究结果为在体外建立脂肪细胞分化模型及为进一步研究PPARγ2 在诱导脂肪细胞分化中的分子机制奠定了基础     

IL—6基因转导大肠癌细胞的表达

目的:IL-6基因导入大肠癌细胞,建立能有效表达IL-6的转导株HT-29IL-6.方法:采用酶切与连接技术构建重组IL-6基因逆转录病毒载体,基因转染包装细胞,C418筛选克隆,常规制备重组病毒液并感染HT-29细胞,筛选抗性细胞,Southern blot和Northem blot分析基因的整合与mRNA转录水平,MTT显色法及ELISA法检测表达产物的量与活性.结果:成功地构建了重组载体pZIPIL-6cDNA,制备了高滴度的重组病毒液(5.1×10~5cft/ml),其感染率达80%以上,建立了HT-29IL-6表达株,杂交结果证实具有目的基因的稳定整合和相应mRNA的有效转录,表达IL-6的量与活性分别为1132.5pg/ml和15OU/ml.结论:逆转录病毒载体介导的IL-6基因通过转染及筛选能稳定整合在大肠癌细胞染色体,并进行有效的转录与表达,为IL-6转基因治疗大肠癌的研究奠定了基础.     

人白细胞介素-1受体拮抗剂或白细胞介素-10逆转录病毒载体的构建与体外实验

目的 构建携带人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1Ra)或人白细胞介素-10(hIL-10)基因的重组逆转录病毒(rRv)，体外转染免滑膜成纤维样细胞，检测目的基因的表达水平与持续时间。方法 提取人外周血单个核细胞总RNA，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因；酶切、连接目的基因与逆转录病毒载体pLXSN，筛出阳性克隆，经GP2-293细胞包装，收集病毒并鉴定；rRV-hlL-1Ra、rRV-hlI-10分别体外转染兔滑膜成纤维样细胞，RT-PcR测定目的基因mRNA表达水平与时间的关系。免疫组织化学与免疫印迹测定蛋白水平的表达与持续时间。结果 成功构建了携带hIL-1Ra或hIL-10基因的重组逆转录病毒，rRv-hIL-1Ra与rRV-hIL-10均能有效转染体外培养的兔滑膜成纤维样细胞，RT-PcR测定目的基因mRNA高峰均出现于转染后第5天左右。免疫组织化学和免疫印迹均检测到hIL-lRa、hlL-10的表达。经G418筛选后的细胞中，hIL-1Ra的表达在转染后第30天内达高峰，至少持续60d：hIL-10的表达至少持续40d。结论 以重组逆转录病毒为载体可以成功地将hIL-lRa或hIL-10基因导人体外培养的兔滑膜成纤维样细胞并实现稳定表达。     

慢病毒介导HBV X基因稳定表达HepG2细胞系的建立

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(HBV X)重组慢病毒表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)的HepG2细胞系.方法:应用PCR法从质粒pIERES2-EGFP-HBV中扩增X基因片段,克隆至慢病毒载体pZac2.1,应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,RT-PCR、免疫组织化学、Western blot鉴定HBx的表达.结果:酶切鉴定和基因序列测定证实长度为489bp的HBx基因成功克隆至慢病毒表达载体pZac2.1-HBx;重组慢病毒经包装、纯化后获得滴度为1×108TU/mL,通过感染HepG2细胞株和嘌呤霉素筛选,8-10d形成生长形态良好的单克隆细胞株HepG2-HBx;RT-PCR鉴定显示细胞株HepG2-HBx在3d,14d,30d和2mo后均可见稳定表达的HBx mRNA;利用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法鉴定,细胞株HepG2-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBV X重组慢病毒载体,获得稳定表达HBx的HepG2细胞系,为进一步研究HBx的生物学功能及致病机制提供细胞模型.     

携带hIL-4逆转录病毒重组体的构建及在类风湿关节炎中体外表达的研究

目的 构建携带人白介素4（hIL-4）表达序列的重组逆转录病毒pLXSN—hIL-4并检测目的基因的表达。方法 2004年6月至12月在中国医科大学基础医学院设计带有酶切位点的引物，含有目的基因的DNA进行聚合酶链反应扩增并纯化目的基因片段。pLXSN与目的基因片段hIL-4进行定向克隆连接，筛出阳性克隆并进行鉴定。扩增重组逆转录病毒载体pLXSN—hIL-4，并转染体外培养的人滑膜成纤维样细胞。Western blotting法测定目的基因蛋白表达水平。结果 成功构建了携带治疗基因的逆转录病毒重组体：rRV—hIL-4。Western blotting法检测到了hIL-4的表达。结论 成功构建了携带治疗基因的逆转录病毒重组体：rRv—hIL-4。以逆转录病毒为载体可以将hIL-4基因导入体外培养的人滑膜成纤维样细胞，转染后的细胞可以表达hIL-4蛋白。     

靶向B7-H3基因RNA干扰慢病毒的构建及人胰腺癌PaTu8988稳定感染细胞株的建立

目的 构建靶向人B7同源性3(B7-H3)基因的小发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,并建立稳定感染的胰腺癌PaTu8988细胞株.方法 根据GenBank提供的B7-H3 cDNA序列,设计4条靶向B7-H3的siRNA序列,构建重组干扰质粒pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA.将重组干扰质粒和过表达B7-H3质粒共同转染293T细胞,经蛋白质印迹法筛选出干扰效果最佳的重组干扰质粒.该质粒经慢病毒包装,并感染胰腺癌PaTu8988细胞株,建立稳定低表达B7-H3细胞株.应用实时定量PCR及蛋白质印迹法检测细胞B7-H3基因的表达抑制率.结果 携带干扰效果最好的shRNA的慢病毒感染PaTu8988细胞,建立了稳定低表达B7-H3基因的PaTu8988细胞株,其B7-H3 mRNA表达的抑制率达96.8％,B7-H3蛋白表达的抑制率达88.1％.结论 成功构建了人B7-H3-RNAi的慢病毒载体,并建立了稳定感染的低表达B7-H3基因的PaTu8988细胞株.     

可溶性TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法:以RT-PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

携带GFP基因逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞

目的应用携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞,为细胞重编程实验提供有效基因转移载体。方法利用酶消化法在体外分离培养脐带基质间充质细胞。应用磷酸钙法将GFP基因转染到293T细胞内,包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。收集病毒上清液感染脐带基质间充质细胞,应用倒置荧光显微镜观察逆转录病毒感染脐带基质间充质细胞情况。结果体外分离培养出脐带基质间充质细胞;293T细胞包装生产携带GFP基因逆转录病毒;包装生产后的逆转录病毒成功地感染脐带基质间充质细胞。结论逆转录病毒可作为有效载体将外源性基因转染入脐带基质间充质细胞内,并且细胞能够稳定表达被导入的外源性基因。