高分辨熔解曲线法检测骨髓增殖性肿瘤患者 JAK2V617F 基因突变简

本研究探讨高分辨率熔解曲线（High resolution melting,HRM）法检测骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者JAK2V617F基因突变的可行性.随机抽取29份2008年1月至2011年1月确诊为MPN患者的骨髓标本,应用HRM法检测JAK2V617F基因突变情况,并与等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）和测序法的检测结果比较分析.结果表明,经HRM法检测,在29份MPN患者骨髓标本中检出JAK2 V617F突变阳性11例,突变率为37.9％;与基因测序法比较,结果完全一致,符合率100％.而AS-PCR法与测序法比较,Kappa=0.179,P=0.316,一致性强度较差.结论：HRM方法具有简便、快速、特异性高等优点,可作为临床JAK2V617F基因突变的优选方法.     

采用荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变

目的 建立荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变的方法,评估JAK2 V617F突变在诊断骨髓增殖性疾病和白血病中的临床意义.方法 选取71例慢性粒细胞性白血病(CML)、22例原发性血小板增多症(ET)、11例原发性骨髓纤维化(PMF)、9例真性红细胞增多症(PV)、7例嗜酸粒细胞增多症患者,分别采用荧光定量PCR、突变特异性扩增系统(ARMS)对JAK2 V617F突变进行检测,并采用基因测序对结果进行验证.将具有JAK2 V617F纯合子突变的人类红白血病细胞株(HEL)DNA作为阳性对照,比较荧光定量PCR和ARMS对JAK2基因V617F突变的检测敏感度.结果 采用荧光定量PCR检测,野生型的熔解温度(Tm)峰出现于(75.0±0.2)℃处,突变型的Tm峰出现于(76.6±0.2)℃处.JAK2基因V617F突变在PV、ET、PMF等骨髓增殖性疾病中的检出率分别为8例(88.9%)、12例(54.5%)、7例(63.6%),但在71例CML中只检出1例(1.4%).荧光定量PCR与ARMS的结果符合率为100%,结果经过测序证实.使用荧光定量PER法可在每106个正常自细胞中检出低至102个HEL细胞,而使用ARMS方法时要在每106个正常白细胞中HEL细胞达到104个时,方可检测出,前者比后者方法灵敏100倍.结论 成功地建立了荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变的方法,比ARMS更灵敏、简便,适合临床使用.JAK2基因V617F突变在骨髓增殖性疾病中有较高的检出率,可作为骨髓增殖性疾病特异性诊断指标.     

骨髓增殖性疾病MPLW515L点突变研究

为了探讨MPLW515L和JAK2V617F点突变在南京地区骨髓增殖性疾病（MPD）中的突变情况，采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）及基因测序方法检测190例MPD患者的MPLW515L和JAK2V617F点突变。结果表明：102例原发性血小板增多症（ET）患者有1例存在MPLW515L点突变，突变率为1．0％；43例存在JAK2V617F点突变，突变率为42．2％。13例特发性骨髓纤维化（IMF）患者未检测到MPLW515L点突变；5例存在JAK2V617F点突变，突变率为38．5％。32例真性红细胞增多症（PV）患者未检测到MPLW515L点突变；20例存在JAK2V617F点突变，突变率为62．5％。43例慢性髓系白血病（CML）患者未检测到MPLW515L和JAK2V617F点突变。结论：AS—PCR检测MPLW515L和JAK2V617F点突变简便可靠。ET患者中可存在MPLW515L点突变，JAK2V617F点突变存在于PV、ET、IMF中，而CML患者不存在JAK2V617F点突变。     

骨髓增殖性疾病JAK2V617F点突变研究

本研究旨在对bcr／abl融合基因阴性的骨髓增殖性疾病（MPD）病人进行JAK2V617F点突变检测,探讨该突变在此类病人中的发生率和临床意义。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测70例典型MPD病人bcr／abl融合基因,用等位基因特异性聚合酶链反应（As—PCR）检测样本JAK2V617F点突变,对有突变的病例进行测序验证。结果表明,慢性髓系白血病（CML）病人bcr／abl融合基因均为阳性,JAK2V617F突变为阴性;余bcr／abl融合基因均为阴性,JAK2V617F阳性率在真性红细胞增多症（PV）病人为75％,在原发性血小板增多症（ET）病人为30％,在特发性骨髓纤维化（IMF）病人为50％。JAK2V617F在CML和bcr／abl阴性MPD病人中的分布有显著性差异（P〈0．05）。结论：JAK2V617F可能为真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化的特征性     

原发性血小板增多症患者JAK2基因突变分析

目的:探讨JAK2V617F基因突变在原发性血小板增多症患者诊断中的价值.方法:采用PCR扩增及产物测序的方法对25例患者和10例正常时照者进行JAK2V617F基因突变检测.结果:25例患者中检测到JAK2基因V617F突变11例,占44%.正常对照者中未检测到该突变.结论:JAK2基因V617F突变在原发性血小板增多症患者中有较高的检出率,可作为临床诊断的指标之一.     

AS-PCR检测慢性骨髓增殖性疾病JAK2 V617点突变及临床意义

目的等位基因特异性聚合酶链反应(alleles specific polymerase chain reaction,AS-PCR)检测慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)中JAK2基因V617F点突变情况并应用于临床诊治。方法AS-PCR检测74例CMPD的患者骨髓或外周血白细胞JAK2V617F点突变。其中真性红细胞增多症(PV)20例、原发性血小板增多症(ET)52例、原发性骨髓纤维化(CIMF)2例。随机抽取其中20例基因测序验证。结果JAK2 V617F阳性率分别为:PV中19/20(95.0%),ET25/52(48.1%),CIMF为2/2(100%)。结论AS-PCR法检测JAK2 V617F敏感性和准确性较高,检测阳性率与国外报道相似;该方法简单易行,适合临床应用于CMPD的诊断分类治疗。     

骨髓增殖性疾病患者JAK2基因V617F突变频率、磷酸化JAK/STAT蛋白表达水平及临床意义

目的 探讨145例骨髓增殖件疾病患者JAK2基因V617F突变率;并分析JAK2基因V617F突变阳性患者的临床特点及意义.方法 应用PCR产物直接测序和等位基因特异性PCR技术检测145例骨髓增殖性疾病患者JAK2基因V617F突变.并应用Western blot方法测定JAK2基因V617F突变阳性患者JAK2蛋白、磷酸化JAK2蛋白及磷酸化STAT5蛋白表达;对JAK2基因V617F突变阳性与突变阴性的骨髓增殖性疾病患者临床资料进行比较,评价JAK2基因V617F突变阳性的临床意义.结果 ①本组病例真性红细胞增多症(PV)、特发性骨髓纤维化(ET)、原发性血小板增多症(IMF)患者JAK2基因V617F突变率分别为92%(64例中59例)、58%(43例中25例)和50%(38例中19例),等位基因特异性PCR检测较PCR产物直接测序有更高的JAK2基因V617F检出率[PV84%(64例中53例)、MIF 44%(43例中19例)、ET 39%(38例中15例)].②JAK2基因V617F突变阳性患者外周血单个核细胞磷酸化JAK2及磷酸化STAT5蛋白表达较突变阴性者明显增高(P<0.05).③JAK2基因V617F突变阳性骨髓增殖性疾病患者发病平均年龄偏大;平均白细胞计数高于突变阴性患者;血小板计数小于突变阴性患者;脾脏较突变阴性患者小;JAK2基因V617F突变阳性PV、ET和IMF患者血栓性事什发生率分别为17%、32%和16%;而突变阴性PV、ET和IMF患者血栓性事件发生率分别为0、16%和5%.结论 骨髓增殖性疾病患者有较高的JAK2基因V617F突变发生率,且JAK2基因V617F突变阳性患者易发生血栓事件.     

多重PCR高分辨熔解分析同时检测骨髓增殖性肿瘤JAK2,MPL及CALR基因突变的初步研究

目的 建立同时检测经典骨髓增殖性肿瘤患者中常见的Janus激酶2(Janus kinase 2, JAK2)、钙网素（calreticulin,CALR）和骨髓增殖性白血病病毒（myeloproliferative leukemia virus,MPL）基因突变的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）-高分辨熔解分析（high resolution melting analysis,HRM）体系。方法 先以各个合成的突变等位基因片段为模板分别进行PCR和HRM分析,优化PCR体系后,在单管中进行多重PCR扩增和HRM分析,同时检测上述三个基因的8种常见突变。结果 在适宜的条件下,上述三个基因的野生型和突变型均能扩增出各自的目的条带和收集到可区分的熔解峰,野生型与突变型的熔解温度差为0.3℃～2.0℃。多重PCR-HRM体系中,除JAK2外显子12相关片段,其他基因均可有效扩增,但JAK2 V617F突变型的扩增效率明显低于MPL及CALR基因。结论 目前该多重PCR-HRM检测体系可鉴别MPL和CALR基因常见突变,但JAK2 V617F突变型...     

特发性骨髓纤维化患者JAK2V617F突变研究

为了探讨特发性骨髓纤维化（IMF）JAK2V617F点突变发生率及其临床意义,运用等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）检测12例IMF患者的JAK2V617F点突变,并探讨JAK2V617F变化与临床、血液学特征的相关性。结果显示：随访期2-15个月,12例患者JAK2V617F点突变检测阳性率为50%,而半数患有血栓史,其血小板数目及骨髓巨核细胞数目相对增多。另6例JAK2V617F点突变阴性患者仅1例有血栓史,血小板数目及骨髓巨核细胞数目相对较低。结论：JAK2V617F点突变阳性IMF患者多数具有典型的临床表现及血液学特点,其血小板数目及骨髓巨核细胞数目相对增多。     

联合检测JAK2V617F、MPLW515L/K和CALR基因突变在原发性血小板增多症患者中的意义

目的研究成人原发性血小板增多症(PT)患者外周循环血液中JAK2V617F、MPLW515L/K和CALR基因的突变率,并分析联合检测的诊断价值。方法共纳入342例单纯血小板持续升高(≥300×109/L)的患者,分别行血常规、骨髓活检和基因检测,共确诊PT患者154例(45.03%),继发性血小板增多症188例。采用等位基因特异性-聚合酶链反应(AS-PCR)检测JAK2V617F和MPLW515L/K的点突变,直接测序法检测CALR基因突变。结果 3种基因的突变型有两条电泳条带,野生型仅有一条;JAK2V617F和MPL突变不引起读码框改变,而CALR突变可导致读码框改变。PT组JAK2V617F和CALR基因突变率显著高于继发组,差异有统计学意义(P0.05);MPL阳性突变率为4.55%。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析,单独检测JAK2V617F突变诊断PT的曲线下面积(AUC)为0.721,敏感度为72.4%,特异度为79.5%;单独CALR突变的AUC为0.664,敏感度为68.4%,特异度为82.4%;JAK2V617F联合CALR突变的AUC为0.862,敏感度为85.9%,特异度为87.8%。结论 PT中以JAK2V617F和CALR突变率较高,联合二者检测可明显提高PT的诊断价值。     

Detection of the JAK2 mutation in myeloproliferative neoplasms by asymmetric PCR with unlabeled probe and high-resolution melt analysis

Background: Several methods have been established to detect the JAK2 V617F mutation, a frequent event involved in the pathogenesis of myeloproliferative neoplasms (MPNs). High‐resolution melt (HRM) analysis is a newly established technique without the requirement of any gel‐based post‐PCR handling. Methods: An asymmetric PCR with unlabeled specific probe was developed and combined to HRM analysis o screen for JAK2 V617F mutation. Results: Heterozygous mutation was easily distinguished from homozygous JAK2 for the obvious shape change. Homozygous JAK2 mutant can be also well separated from wild‐type JAK2 in the presence of internal temperature calibrators. The easily recognizable and maximal sensitivity of HRM analysis was 5% for the detection of JAK2 V617F mutation, higher than 25% of direct sequencing. In the test of blind screening of 223 samples (111 Ph? MPNs, 60 Ph+ chronic myeloid leukemia, and 52 acute myeloid leukemia), JAK2 V617F mutations were found in 78 (70%) patients with MPNs, but in none with chronic and acute myeloid leukemia. HRM analysis of all cases was fully concordant with the results of PCR‐RFLP and direct sequencing. Conclusions: The HRM method with unlabeled probe could be used as convenient, sensitive and reliable diagnostic test for detection of JAK2 V617F mutation. J. Clin. Lab. Anal. 25:300–304, 2011. © 2011 Wiley‐Liss, Inc.     

Rapid detection of JAK2 V617F mutation using high-resolution melting analysis with LightScanner platform

BackgroundDetection of the JAK2 mutation has recently been included under the essential diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasm (MPN). High-resolution melt (HRM) curve analysis, a nongel-based, automated system, is introduced as a means of mutation scanning without the requirement of any post-PCR handling.MethodsWe studied the sensitivity and reproducibility of LightScanner? platform in the detection of JAK2 V617F mutation and the availability for diagnostic use in MPN.ResultsThe reproducible sensitivity of HRM analysis with LightScanner? platform was 5% for the detection of JAK2 V617F mutation. In the test of blind screening of 105 samples (48 Ph? MPN and 57 Ph+ chronic myeloid leukemia), the identical judgement was interpreted by two blinded investigators. HRM analysis of all cases was fully concordant with the results of PCR-RFLP and direct sequencing.ConclusionsThe HRM method developed here is an extremely sensitive, accurate and reliable technique and allows high-throughput, fast pre-screening to select for sequencing only those specimens that most likely contain mutant JAK2 V617F allele(s).     

骨髓增生性疾病JAK2~(V617F)突变检测方法的比较研究

目的研究较好的检测骨髓增生性疾病(MPD)患者中JAK2~(V617F)点突变的方法。方法分别应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)检测16例慢性粒细胞白血病(CML)、22例真性红细胞增多症(PV)、26例原发性血小板增多症(ET)、12例慢性特发性骨髓纤维化(IMF)外周血单个核细胞基因组DNAJAK2~(V617F)点突变,结果经测序鉴定。结果测序证实经AS-PCR检测PV的阳性率为72.7%,比PCR-RFLP的阳性率(50%)检测提高22.7%;ET的阳性率为42.3%,比PCR-RFLP的阳性率(34.6%)检测提高7.7%。其中经PCR-RFLP检测的阳性样本全部包含在AS-PCR检测的阳性样本之中,二者结果均与测序结果相符。结论 AS-PCR与PCR-RFLP相比检测敏感性高,且操作简便、快捷,更具有临床大规模检测的应用价值。     

TaqMan探针结合COLD-PCR原理定量检测JAK2 V617F突变率研究

目的建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的方法。方法应用TaqMan/MGB探针技术,结合较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应(COLD-PCR)基因扩增原理,采用Real-Time PCR分析系统,通过JAK2V617F突变率和其循环阈值(Ct值)的标准曲线,建立TaqMan-COLD-PCR测定方法,并对9例骨髓增殖性疾病(MPD)患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测,探讨其应用价值。结果建立的TaqMan-COLD-PCR方法检测JAK2V617F突变率的检测下限为0.1%,100%-0.1%的JAK2V617F突变率与其测定的Ct值间呈明显的线性关系。对9例MPD患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中6例患者的JAK2V617F突变阳性,突变率范围为18.5%-50.9%,经测序确认全部符合。结论 TaqMan-COLD-PCR方法可高灵敏度、定量检测外周血中JAK2V617F突变率。该方法将明显提高MPD疾病的诊断灵敏度,并有助于疾病治疗过程中治疗效果的监测。     

多重位点特异性PCR检测骨髓增殖性疾病五种JAK2基因突变

目的 建立一种同时检测多种JAK2基因突变的多重位点特异性PCR方法,并探讨其对骨髓增殖性疾病(MPD)的临床应用价值.方法 建立同时枪测JAK2 V617F突变和JAK2 exon12中K539L(包括2种基因突变)、N542-E543del和E543-D544del突变的多重位点特异性PCR方法.对115例MPD患者进行检测,包括61例真性红细胞增多症(PV)患者、43例原发性血小板增多症(ET)患者和11例原发性骨髓纤维化(MF)患者.结果 建立的PCR方法可以同时检测上述5种JAK2基因突变,可以检测出1%的JAK2 V617F突变型等位基因,对其他几种突变可检测出0.1%的突变型等位基因.在61例PV患者中,检测出JAK2 V617F突变56例、JAK2 exon12突变3例;在43例ET患者中,检测出JAK2 V617F突变27例,未检测到JAK2 exon12突变;在11例MF患者中,检测到JAK2 V617F突变6例,未检测到JAK2 V617F突变.3例JAK2 exon12突变的患者临床表现为血红蛋白增多,内源性红系集落生成阳性,但白细胞和血小板增多不明显,不伴脾肿大.结论 多重位点特异性PCR方法检测灵敏度高,可联合检测5种JAK2基因突变,能有效提高突变检出率.     

等位基因特异性引物和TaqMan-MGB探针双抑制野生等位基因扩增的实时荧光定量PCR检测JAK2V617F突变率

本研究建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的荧光定量PCR检测方法并探讨其临床应用价值。在实时荧光定量PCR分析系统中,应用等位基因突变引物和等位基因野生TaqMan-MGB探针共同抑制JAK2V617F野生等位基因扩增,从而特异性地扩增JAK2V617F突变等位基因。通过测定不同JAK2V617F突变率标准品及其循环阈值(Ct值),建立JAK2V617F突变率定量测定方法,并对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测。结果表明,建立的方法定量检测JAK2V617F突变率的下限为0.1%,检测JAK2V617F突变率的批内、批间平均变异率分别为4.1%和6.1%。对89例表观健康人外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中2例为JAK2V617F阳性,突变率分别为0.64%和0.98%。结论:建立的JAK2V617F突变率定量检测方法具有检测灵敏度高和重复性好的特性,适合骨髓增殖性疾病的诊断及疾病进程和疗效监测。本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景。